基于DNA纳米结构变换介导的PEC和FL双信号策略检测方法

本发明属于检测领域，具体涉及一种基于dna纳米结构变换介导的pec和fl双信号策略检测htrna和rnase h的方法。

背景技术：

1、人端粒酶rna(htr)是合成端粒重复序列的端粒酶模板，以维持端粒的恒定长度。在正常细胞中，每次细胞复制后端粒缩短导致细胞衰老和死亡。相反，在大多数肿瘤细胞中，由于端粒酶的作用，端粒的长度保持不变，使肿瘤细胞无限分裂。而端粒酶活性的鉴定可以通过htr检测来实现。与端粒酶相比，htr的表达水平与肿瘤的形成更密切。此外，人体内几乎所有的代谢反应都需要酶的参与，而物质代谢的控制大多是通过酶活性的调节来实现的。核糖核酸酶h(rnase h)是一种内切核糖核酸酶，能特异性地降解dna-rna杂合链中的rna，进而参与重要的生物学过程，如基因复制和转录，以及dna损伤修复。因此，建立一种简便、灵敏的识别和定量检测htr和rnase h方法对疾病早期的诊断和筛查具有重要价值。

2、到目前为止，检测htr的方法很少，包括northern印记分析法、原位杂交和逆转录聚合酶链式反应。虽然这些方法可以检测到令人满意的灵敏度和检出限，但仍存在操作复杂、耗时长等缺点。近年来，随着纳米技术的发展，出现了一些检测htr的新方法。wei课题组利用寡核苷酸锚定银纳米簇来检测htr模板。xu课题组使用基于脚趾链置换(tsdr)和流式细胞仪分析法实现了对htrs的超灵敏和可靠检测。与此同时，一些利用激活探针进行无标记荧光法检测rnase h的方法被广泛应用，但金属发光剂的加入会影响rnase h的活性。而基于信号放大策略的方法，如催化发夹组装(cha)、脱氧核酶切割底物和滚环扩增(rca)等，具有较高灵敏度和较好的生物相容性，被广泛应用于rnase h的检测。尽管上述传感策略对检测htr和rnase h具有良好的灵敏度和选择性，但其只能在同一系统中检测单个靶标。然而，疾病的产生往往伴随着多种生理变化的过程，比如癌症标志物的出现、酶活性的改变、蛋白浓度的改变以及激素水平的改变。而当前的检测方法主要用于检测一种或两种同类物质，作为早期疾病诊断的依据。虽然具有较高的灵敏度和选择性，但是在对疾病的诊断、确诊等方面的能力不足，容易造成影响严重的误诊现象。因此，迫切需要开发一种新的具有良好的检测范围的方法来同时检测与疾病相关的不同类的靶标。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：为了克服单模式检测方法的局限性，我们创新的提出了一种基于光电化学(pec)模式和荧光(fl)模式的双模式传感平台。双模式检测方法不仅具有每种检测模式的特性，而且在不同模式下检测结果可以相互检查，有效地提高了检测结果的准确性和可信度。

2、本发明的技术方案为：一种基于dna纳米结构变换介导的pec和fl双信号策略检测htrna和rnase h的方法，包括如下步骤：

3、(1)n-tio2@au纳米颗粒电极的制备

4、首先，通过静电纺丝将氮掺杂tio2纳米线修饰在fto电极上，再经过抗坏血酸还原au nps，制备出光电极材料n-tio2@au nps。

5、(2)靶标识别和信号扩增反应

6、a、针对htrna靶标设计挂锁探针，将挂锁探针与待测样本混合，进行滚环转录；

7、b、以htnar靶标序列为引发链，设计两条发卡探针hp1与hp2，将两条发卡探针与步骤(1)滚环转录的产物混合进行杂交链式反应，使发卡探针序列连接到htrna靶标序列上；其中一条发卡探针标记有荧光染料，另一条发卡探针通过氨基连接有cds量子点；

8、(3)将步骤(2)的杂交链式反应液加到步骤(1)的n-tio2@au纳米颗粒电极上作为工作电极，以铂丝为对电极进行pec测量；并同时进行荧光检测。

9、进一步地，所述挂锁探针的核苷酸序列如seq id no.1所示，且5’端磷酸化。

10、进一步地，所述发卡探针hp1的核苷酸序列如seq id no.3所示，且5’端标记cy3；发卡探针hp2的核苷酸序列如seq id no.4所示，且5’端氨基修饰。

11、进一步地，所述连接链s1的核苷酸序列如seq id no.2所示，且5’端巯基修饰。

12、进一步地，所述htrna靶标序列的核苷酸序列如seq id no.5所示。

13、进一步地，滚环转录时，t7 rna聚合酶浓度为40u/ml。

14、进一步地，进行杂交链式反应时，发卡探针hp1的浓度为5μm。

15、进一步地，进行杂交链式反应时间为5h。

16、进一步地，所述发卡探针通过氨基连接有cds量子点的制备方法为：所述将30μl浓度为0.5mg/ml的cds量子点加入到3.3μledc/nhs的混合溶液中，在37℃下活化反应1h，然后加入10μl浓度为25μm的seq id no.4所示的发卡探针，将混合物放入37℃摇床中反应12h，得到cds qd-hp2偶联物。

17、一种检测试剂盒，含有挂锁探针、发卡探针hp1、发卡探针hp2和连接链s1：

18、挂锁探针：核苷酸序列如seq id no.1所示,且5’端磷酸化。

19、发卡探针hp1：核苷酸序列如seq id no.3所示，且5’端标记cy3；

20、发卡探针hp2：核苷酸序列如seq id no.4所示，且5’端氨基修饰。

21、连接链s1：核苷酸序列如seq id no.2所示，且5’端巯基修饰。

22、我们创新的提出了一种基于dna纳米结构变换介导的pec和fl双信号策略用于同时灵敏、精确地检测htrna和rnase h。在该系统中，基于rct和hcr扩增技术形成的dna纳米结构，可将信标物质cy3和cds qds富集到电极表面，从而实现了信号的输出；并且利用dna纳米结构的性质，实现了dna纳米结构的转换，从而使该传感器能够同时精准的检测htrna和rnase h。此外，利用au纳米粒子的lspr效应实现了电极极性的转换，避免了复杂生物样本基底的干扰，保证了可靠性。该双模式传感器可以达到显著的检测极限(0.02402fm和6.0mu/ml)，并且具有良好的稳定性和选择性。基于对早期疾病分析诊断的需求，该策略在应用于临床检测中显示出巨大潜力。

23、本发明的双模式检测方法不仅具有每种检测模式的特性，而且在不同模式下检测结果可以相互检查，有效地提高了检测结果的准确性和可信度。在pec检测的实际应用中，由于样品中共存的各种非氧化还原干扰物和氧化还原干扰物会导致光电流的减小或增大，信号关闭或信号开启策略都不能避免假阳性或假阴性信号。为了提高检测结果的可靠性和准确性，我们组利用au纳米粒子的表面等离子体共振效应(lspr)提出了一种光电流极性切换策略，即当没有靶标存在时输出阴极背景信号，只有当靶标存在时才会诱导光电流极性的切换，其他干扰物不能切换光电流极性，在避免假阳性或假阴性结果方面具有很大的优势。