一种鸭疫里氏杆菌弱毒株及其构建方法和应用

本发明涉及动物细菌基因工程，特别是涉及一种鸭疫里氏杆菌弱毒株及其构建方法和应用。

背景技术：

1、鸭疫里氏杆菌(riemerella anatipestifer)属于黄杆菌科里氏杆菌属，是一种能感染鸭、鹅和火鸡等禽类的细菌。rossau、segers等对该病原与黄杆菌/噬纤维菌群的成员进行了比较研究，并通过分析r.anatipestifer的rrna，发现它们具有较多的相似性，但由于r.anatipesti fer在蛋白质及脂肪酸组成、培养特性、酶活性等许多方面又明显不同于黄杆菌/噬纤维菌rr na同源群中关系较近的其它细菌，因此segers等提出将r.anatipestifer归入黄杆菌/噬纤维菌rrna同源群，并建议单列一属，称为里氏杆菌属，其代表种为鸭疫里氏杆菌，并将该菌所引起的疾病命名为鸭疫里氏杆菌病。鸭疫里氏杆菌感染鸭的临床症状主要表现为眼鼻有脓性分泌物，轻微咳嗽打喷嚏、头颈部震颤、黄绿色腹泻、共济失调和抽搐，慢性病例倒卧不起可出现神经症状。鸭传染性浆膜炎病理变化为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和关节炎。该病主要通过呼吸道、消化道和皮肤伤口感染2-5周龄的雏鸭，发病率高达100％，死亡率通常在5-75％，具体取决于菌株的毒力，病后雏鸭生长迟缓，成年鸭可能只会引起亚临床症状甚至无症状感染。因此很难检测和根除这种疾病，该病的流行会导致重大的经济损失，是危害养鸭业的主要传染病之一，给现代集约化养鸭业带来了巨大的威胁。该病自1904年被首次报道以来，在全球各养鸭场都有流行。

2、鸭疫里氏杆菌是革兰阴性，无芽胞，无鞭毛，杆状，能形成荚膜的细菌，菌体长1-5nm，宽0.2-0.4nm，多数单个存在，少见成对排列，偶排列成长条状，瑞氏染色可见两极着色，印度墨汁负染可使荚膜着色。该菌对生长条件要求苛刻，在普通琼脂和麦康凯培养基上不生长，可在胰蛋白胨大豆琼脂(tsa)、血琼脂和巧克力琼脂上生长，最适生长温度为37℃，在含有5-10％的二氧化碳环境下可促进生长，菌落呈圆形、稍突起、表面光滑，直径为1-1.5mm。即便是在最适培养条件下，大多数细菌在固体培养基上存活不超过3-4天，冻干菌可长时间保存。

3、与许多其它黄杆菌科细菌不同，鸭疫里氏杆菌不能发酵碳水化合物，但由于鸭疫里氏杆菌的血清型众多，生化反应也不尽相同，少部分菌株可以通过葡萄糖、麦芽糖、肌醇和果糖产生酸。总的来说，鸭疫里氏杆菌不产生硫化氢，不能利用枸橼酸盐，不能利用柠檬酸盐，甲基红试验阴性，硝酸盐还原试验为阴性，vp试验阴性，过氧化氢酶试验阳性，触酶试验阳性，大多可液化明胶，磷酸酶、亮氨酸和胱氨酸-芳香酰胺酶、磷胺酶试验均为阳性，鸟氨酸与赖氨酸脱氢酶试验等均为阴性，有些菌株尿素酶和精氨酸双水解酶试验为阳性。一般来说，鸭疫里氏杆菌对青霉素、链霉素、壮观霉素、红霉素等多种抗生素敏感，对卡那霉素、庆大霉素等有抵抗力。

4、凝集试验或琼脂凝胶沉淀试验是对鸭疫里氏杆菌分离株进行血清分类最广泛的方法，血清型的准确检测对控制鸭疫里氏杆菌感染具有重要的现实意义。鸭疫里氏杆菌血清型复杂，目前最少分离出21种血清型，血清型不同，发病率与死亡率也不同，即使是同一血清型之间也存在毒力差异，且各血清型制备的灭活疫苗均未观察到明显的交叉保护作用。血清型的流行因国家和时间而异。根据文献报道，血清1、2和5型是美国最常见的血清型，而血清1、7、10和15型经常在新加坡鸭场暴发。血清7型是泰国最普遍的血清型，其次是血清1、5、10和21型，血清4型是丹麦的主要血清型，这是目前仅感染鹅的血清型，血清1型是匈牙利最普遍的血清型。在我国，自1982年首次报道鸭疫里氏杆菌以后，血清型越来越复杂，其中主要流行的血清型为血清1型(34.6％)和2型(19.9％)，两种血清型的毒力和代谢能力在血清型之间和内部都有一定的差异，虽然对这两种菌株的许多致病性和抗药性因素进行了一些研究，但有关生长和感染所需代谢途径的数据，特别是碳和氮源的自然利用方面数据尚不清楚。不管是新分离出的血清型，还是已分离出的血清型，这都给鸭疫里氏杆菌的防治带来了巨大的挑战。因此针对鸭疫里氏杆菌流行优势血清型研制单价或多价弱毒活疫苗将为鸭疫里氏杆菌病的防控提供重要手段。目前，已有大量国内外学者对鸭疫里氏杆菌的弱毒活疫苗进行了研究，但迄今为止还未有一个商品化的弱毒活疫苗投入生产。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种鸭疫里氏杆菌弱毒株及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该鸭疫里氏杆菌弱毒株在保留良好的免疫原性的基础上，毒力显著降低，可用于制备弱毒疫苗，尤其是弱毒活疫苗，从而可以为鸭疫里氏杆菌病的防控提供重要的技术支持。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种鸭疫里氏杆菌(riemerella anatipestifer)弱毒株，所述鸭疫里氏杆菌弱毒株于2023年10月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为：cctcc no:m20231887。

4、本发明还提供一种鸭疫里氏杆菌弱毒株的构建方法，包括将鸭疫里氏杆菌亲本株的cyclase基因敲除，构建得到所述鸭疫里氏杆菌弱毒株的步骤；

5、所述cyclase基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、进一步地，通过克隆所述鸭疫里氏杆菌亲本株的cyclase基因的上下游同源臂，构建重组自杀性质粒，利用接合转移方法将所述cyclase基因敲除。

7、本发明还提供上述的鸭疫里氏杆菌弱毒株在制备鸭疫里氏杆菌弱毒疫苗中的应用。

8、进一步地，所述弱毒疫苗为弱毒活疫苗。

9、进一步地，所述弱毒活疫苗为单价疫苗，所述鸭疫里氏杆菌弱毒株为唯一活性成分。

10、本发明公开了以下技术效果：

11、1.本发明首次通过将鸭疫里氏杆菌中cyclase基因进行缺失，获得了可稳定传代的弱毒株，为探讨鸭疫里氏杆菌致病机理及研制基因工程活疫苗提供了依据。

12、2.本发明所得到的鸭疫里氏杆菌cyclase基因缺失突变株的毒力显著降低，与亲本株相比，cyclase基因缺失株的毒力下降了约1.23×106倍，但仍然保留有良好的免疫原性，通过颈背部皮下注射注射cyclase基因缺失突变株(1.0×105cfu/只与1.0×106cfu/只)免疫雏鸭一周后攻毒野生株1.0×105cfu/只，对照组5只雏鸭全部死亡，两免疫组雏鸭全部存活，cycl ase基因缺失株对雏鸭的免疫保护率达100％。

13、3.利用本发明所得的cyclase基因缺失突变株制备弱毒活疫苗，与传统灭活疫苗相比，其生产工艺简单，生产成本较低，通过给雏鸭免疫接种，能提供良好的免疫保护。

14、4.本发明构建cyclase基因缺失突变株所使用的亲本菌株，其血清型为血清1型，血清1型是我国目前流行的血清型，因此以该菌株为亲本菌构建的cyclase基因缺失突变株，并以此为基础研制单价或多价弱毒活疫苗，将为鸭疫里氏杆菌病的防控提供重要的技术支持。