一种新德里番茄曲叶病毒侵染性载体、VIGS载体及应用

本发明涉及农业科学，具体涉及一种新德里番茄曲叶病毒侵染性载体、vigs载体及应用。

背景技术：

1、新德里番茄卷叶病毒(tolcndv)是双生病毒科(geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(begomovirus)的成员，是一种由烟粉虱传播的病毒。tolcndv是一种对甜瓜、番茄等作物造成毁灭性危害的植物病毒。该病毒最早于1995年在印度发现，而后迅速蔓延至巴基斯坦、印度尼西亚、孟加拉国、泰国等亚洲国家，2012年以后，传入西班牙、土耳其等欧洲国家，严重影响当地的黄瓜、西葫芦、西瓜、番茄等产业。该病毒被欧洲和地中海植物保护组织(european and mediterranean plant protection organization，eppo)列入警戒名单，土耳其、美国、阿根廷等国并将其列入当地检疫目录。据eppo统计，tolcndv的主要寄主包含有葫芦科、茄科、豆科等作物、杂草70余种，其中甜瓜、西瓜、黄瓜、西葫芦、番茄、土豆等19种作物被列为主要寄主。

2、tolcndv基因组由两个大小约2.7kb的环状dna分子组成，分别被命名为dna-a和dna-b。dna-a包含av1、av2、ac1、ac2、ac3和ac4基因，dna-b含有bv1和bc1基因。dna-a和dna-b包含一个约160nt大小保守的共同区域(common region，cr)，又称大基因间区(largeintergenic region，lir)，将基因组的第一个orf和互补链的第一个orf间隔开，该序列与基因组复制和基因转录密切相关。

3、病毒诱导的基因沉默(virus-induced genesilencing，vigs)是用于植物内源基因功能研究的最高效反向遗传学技术之一，已经成为植物病毒学研究、植物基因功能研究最常用的手段。vigs是利用植物中双链rna(double strand rna，dsrna)介导的抗病防御机制，在重组病毒携带了植物的内源基因序列并侵染植物时，植物的转录后水平的基因沉默(post-transcriptional gene silencing，ptgs)被诱发，从而植物内源基因的rna被特异性的降解，导致内源基因被沉默，引起植物表型的变化，应用这些变化来研究内源基因的功能。vigs技术广泛应用于草本植物和木本植物生长发育、信号传导、代谢途径、抗逆等相关基因功能鉴定方面的研究。tolcndv是一种危害性大、寄主范围广的植物病毒，为保护产业、保障生产，对其开展基因功能研究、资源化利用等方面具有很重要的意义。

4、构建植物的遗传体系、转基因来研究植物基因功能是一个步骤繁琐、周期长的过程，而用vigs技术来研究植物内源基因功能更方便和快捷。但是目前，没有利用tolcndv的vigs载体来研究甜瓜内源基因的方法，这使得植物内源基因功能的研究进程受到了极大阻碍。

技术实现思路

1、本发明提供了一种新德里番茄曲叶病毒侵染性载体、vigs载体及应用，旨在解决现有技术中研究植物基因功能的步骤繁琐和周期长技术问题。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种新德里番茄曲叶病毒侵染性载体，包括：dna-a载体和dna-b载体；所述dna-a载体由新德里番茄曲叶病毒中基因组dna-a构建入双元载体获得，所述dna-b载体由新德里番茄曲叶病毒中基因组dna-b构建入双元载体获得。

4、优选的方案，所述新德里番茄曲叶病毒载体的构建方法包括：

5、s1、新德里番茄曲叶病毒序列的获取：设计引物并进行pcr扩增获得基因组dna-a和dna-b；

6、s2、新德里番茄曲叶病毒载体的构建：将所述基因组dna-a和所述dna-b序列分别构建入双元载体，获得dna-a载体和dna-b载体。

7、优选的方案，在步骤s1中，所述基因组dna-a和dna-b均含有两个完整ir区域。

8、基于上述方案，叶绿体基因组的ir区域的边界区序列可能会向外延伸扩张，也可能向内部收缩，从而导致相关基因拷贝数的变化，或者导致边界区域假基因的产生，所以dna-a和dna-b需要均含有两个完整ir区域，避免出现基因拷贝数和假基因。

9、优选的方案，在步骤s1中，所述引物为seq id no.1-seq id no.8，所述引物seqid no.1-seq id no.8的基因序列分别为：

10、seq id no.1：ggggtaccccattctagaacgtctccgtctttg，

11、seq id no.2：cgacgcgtgcatgccacttccgtaacact，

12、seq id no.3：atggagctcgtgcagttgt，

13、seq id no.4：cgacgcgtcataggggctgtcgaagttgag，

14、seq id no.5：cgggatccgggggtaccaatgttttgccgacgacaacttc，

15、seq id no.6：gcgagctcatttccttacgcgtatattgtttggag，

16、seq id no.7：tccaaacaatatacgcgtaaggaaatc，

17、seq id no.8：gcgagctcgattggatcaccaaacagttcagttg。

18、第二方面，本发明提供了一种新德里番茄曲叶病毒vigs载体，包括构建有目的植物基因的cdna片段的所述dna-a载体。

19、优选的方案，所述新德里番茄曲叶病毒vigs载体的构建方法包括：

20、s1、获取目的植物基因的cdna片段；

21、s2、对dna-a载体的部分基因进行缺失，并设计引物加入多克隆位点；

22、s3、将所述目的植物基因cdna片段插入dna-a载体的多克隆位点后获得新德里番茄曲叶病毒vigs载体。

23、优选的方案，在所述步骤s1中，用植物内源基因的引物进行cdna第一链的合成，继而进行rt-pcr扩增，获得目的植物基因cdna片段。

24、基于上述方案，采用rt-pcr扩增，灵敏度比较高，可以直接扩增特定基因的cdna序列。

25、优选的方案，在步骤s2中，所述dna-a载体的部分基因为av1基因。

26、优选的方案，在步骤s2中，所述引物为seq id no.9-seq id no.12，所述引物seqid no.9-seq id no.12的基因序列分别为：

27、seq id no.9：gggtaaccttaatgcatgttcttcaccgttgct，

28、seq id no.10：ctggtaaccttaataaatatccagttttatatcatacgaag tc，

29、seq id no.11：catgccatggcttcgcacctgcagaagagt，

30、seq id no.12：gggtaacccgaccttggggttttaacaacgtg。

31、第三方面，一种新德里番茄曲叶病毒vigs载体在植物基因沉默中的应用。

32、本发明的有益效果：

33、1、本发明提供的一种新德里番茄曲叶病毒侵染性载体是一种具有极高研究和应用价值的分子工具，利用这个工具可以对病毒进行分子改造：突变、重组、插入、缺失等操作，可应用于该病毒的基因组结构、功能的研究，是一个研究此病毒以及此病毒与寄主互作的重要载体。

34、2、本发明提供新德里番茄曲叶病毒vigs载体一般在接种后7-10天就可以在植物体内大量扩增繁殖，作用温和，对植株伤害小，早起不造成严重的症状；效果稳定高效，植物沉默时间持久，在接种后90天仍然有沉默效果。此外，本发明提供的新德里番茄曲叶病毒vigs载体还能通过系统侵染，在叶片、花朵和果实等部位都会显示沉默症状，导致叶片和花等出现光漂白症状。

35、3、本发明提供的新德里番茄曲叶病毒载体的构建方法和新德里番茄曲叶病毒vigs载体放入构建方法操作简洁高效，仅需常用的pcr仪器、内切酶和连接酶等仪器试剂便能完成；且不需要额外插入启动子等序列片段，引入的多克隆酶切位点还方便植物基因组功能的研究。