一种从苦瓜中提取的多肽及其在治疗糖尿病中的用途的制作方法

：本发明属于生物技术研发领域，具体提供了一种从苦瓜中提取的多肽及其在治疗糖尿病中的用途。

背景技术

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背景技术：

1、全球肥胖和2型糖尿病(type 2diabetes，t2d)的患病率估计值继续上升，肥胖是t2d的一个重要风险因素，超过三分之二的患者在诊断时超重或肥胖。肥胖和t2d都与许多并发症的高易感性有关，包括非酒精性脂肪肝、心血管和肾脏疾病，这些疾病是导致死亡的主要原因。尽管减肥可以显著降低t2d及其合并症的风险和进展，但众所周知，仅靠改变生活方式很难实现和维持足够的减肥效果。胰岛素的降血糖作用与体重增加有关，如果可以通过消除过度肥胖来缓解胰岛素抵抗，大多数t2d患者在诊断时都有足够的β细胞储备来支持接近正常的葡萄糖稳态。因此，现在相当多的注意力集中在其他基于肽的干预措施上，这些干预措施可以同时解决高血糖和过度肥胖问题。

2、在众多可治疗糖尿病的药物或试剂中，多肽类物质得到广泛的关注。胰高血糖素样肽-1受体激动剂(glp-1ra)已被证明在超重或肥胖t2d的治疗中作为降血糖和减肥剂特别有效，目前在大多数国家可作为每日一次和每周一次的注射制剂使用(参见m.a.nauck,d.r.quast,j.wefers,j.j.meier jj，glp-1receptor agonists in the treatmentoftype 2diabetes–state-of-the-art，mol.metab.,46(2021),pp.1-26)，它们通过增强营养刺激的胰岛素分泌、减少胰高血糖素分泌和延迟胃排空来抑制餐后血糖偏移，并通过神经介导的饱腹感效应促进减肥。这些药物有益心血管作用的证据最近提高了它们在治疗指南中的重要性，特别是对于患有动脉粥样硬化性心血管疾病的肥胖t2d患者。另一种基于肽的降血糖剂是普兰林肽(symlin)，它是淀粉样蛋白(胰岛淀粉样多肽)的类似物，形成淀粉样原纤维的倾向降低，这种化合物作为胰岛素的辅助药物使用有限(主要在美国)，因为它能够减少胰高血糖素分泌，减缓胃排空和降低食欲(参见m.c.riddle,k.c.yuen,t.w.debruin,k.herrmann,j.xu,p.ohman,et al.fixed ratio dosing of pramlintide withregular insulin before a standard meal in patients with type 1diabetesdiabetes obes.metab.,17(2015),pp.904-907)。此外，2005年，天然glp-1ra艾塞那肽(byetta)被批准用于治疗t2d患者，这为肠促生长素肽的长效类似物的设计和开发提供了动力。

3、但是多肽类物质具有一些缺陷，限制了其在糖尿病治疗中的应用，如已被批准临床应用的艾塞那肽，其肽链长度较短导致体内半衰期较短，每天需要两次皮下注射，如此频繁的注射频次大大降低了患者的可接受性，也使得血糖控制水平处于不稳定的状态。为此，研究人员开发了多种可延长其半衰期的策略，包括：用羧酰胺(conh2)取代c-末端羧酸(cooh)以赋予对羧肽酶降解的抗性(参见t.zimmermann,l.thomas,t.baader-pagler,p.haebel,e.simon,w.reindl,et al.bi 456906:discovery and preclinicalpharmacology of a novel gcgr/glp-1r dual agonist with robust anti-obesityefficacy mol.metab.,7(2022),article 101633)；用非天然氨基酸取代天然肠促胰岛素中的l-氨基酸，以赋予对蛋白水解酶，特别是dpp-iv的抗性；赖氨酸残基的ε-氨基通过间隔分子与脂质部分结合，以促进与白蛋白的结合。

4、植物来源的食物中蕴含了大量活性多肽，其中某些多肽具有较强的降血糖作用，例如从燕麦球蛋白中获取的燕麦肽能够有效地抑制caco-2细胞中dpp-ⅳ的活性，对α葡萄糖苷酶也有一定的抑制作用(参见wang f,zhang y,yu t,et al.oat globulin peptidesregulate antidiabetic drug targets and glucose transporters in caco-2cells.jfunct foods,2018,42:12-20)。wang等通过体外细胞实验和体内实验研究了核桃蛋白水解肽的抗糖尿病活性，核桃蛋白水解物通过超滤的方法分离出3种不同分子量大小的多肽组分，发现中等分子量(3～10kda)的核桃水解肽表现出最高的α-葡萄糖苷酶抑制率(61.73％)，能够有效地降低血糖水平(参见wang j,du k,fang l,et al.evaluation ofthe antidiabetic activity ofhydrolyzedpeptides derived from juglansmandshurica maxim.fruits in insulin-resistant hepg2 cells and type 2diabeticmice.j food biochem,2018,42(3):e12518)。karimi等发现玉米胚芽蛋白水解物的抗糖尿病潜力与蛋白酶的种类有关,研究表明风味蛋白酶水解物(<2kda)对α-葡萄糖苷酶抑制效果最佳(41.3％),碱性蛋白酶水解物(2～10kda)表现出最强的α-淀粉酶抑制活性(71.3％)和最强的dpp-ⅳ的抑制活性(45.9％)(参见karimi a,azizi mh,ahmadigh.fractionation of hydrolysate from corn germ protein by ultrafiltration:invitro antidiabetic and antioxidant activity.food sci nutr,2020,8(5):2395-2405)。khanna通过有机酸和醇提取，采用薄层层析方法首次从苦瓜果实和种仁中分离纯化出降糖多肽-p，因其提取方式与动物胰岛素相似，且薄层层析迁移率与动物胰岛素一致(参见khanna p，jain s c，panagariya a，et al.hypoglycemic activity of polypeptide-pfrom a plant source.journal of natural products，1981，44(6):648－655)。

5、在上述研究基础上，本发明从苦瓜提取物中分离获得了一种新型降血糖肽ms-78d，可有效降低血糖浓度，并且在其基础上对氨基酸序列结构进行了改造，引入一些非必须氨基酸，延长了其体内半衰期，改善了血糖控制效果。

技术实现思路

1、本发明中的第一方面提供了一种降血糖肽ms-78d，所述降血糖肽的氨基酸序列如seq id no.1所示。

2、苦瓜，属于葫芦科植物，起源于印度，广泛的种植在热带和亚热带地区，现代药理学研宄表明，苦瓜是一种“药食同源”的植物，具有广泛的健康益处和功能活性。由于苦瓜富含丰富的糖类、维生素、蛋白质、粗纤维、钙和铁等营养成分，常被作为功能性食品的原料，可被加工为茶、酒、饮料、果脯、糊状、凉品等。许多研究表明，苦瓜具有降糖、降脂、抗炎、抗菌、免疫调节等作用，其活性成分包括皂苷、多糖、多肽、类黄酮、生物碱和留醇等。本发明从苦瓜中提取获得了具有新型结构的降血糖肽，能够降低血糖浓度，调节机体糖代谢。

3、本发明中的第二方面提供了一种降血糖肽ms-78d的衍生物，将所述降血糖肽的特定位点替换为非天然氨基酸。

4、进一步的，所述非天然氨基酸包括但不限于2-氨基脂肪酸aad、2-氨基异丁酸aib、异锁链素ide、2-氨基庚二酸apm、正亮氨酸nle、3-氨基异丁酸βaib、正缬氨酸nva。

5、现有技术中尝试了多种使用非天然氨基酸替代降血糖肽中已知氨基酸的方式，如在长效glp-1r激动剂索马鲁肽、glp-1r/gipr双激动剂替西帕肽以及pemvidutide nn1171、sar441255和retatutide中，ala-2残基被α-氨基异丁酸(aib)取代(参见t.coskun,k.w.sloop,c.loghin,j.alsina-fernandez,s.urva,k.b.bokvist,et al.ly3298176,anovel dual gip and glp-1receptor agonist for the treatment of type 2diabetesmellitus:from discovery to clinical proof of concept.mol.metab.,18(2018),pp.3-14)；在bi456906中，ala-2残基被1-氨基-1-环丁烷羧酸取代；sar441255对酶降解的额外抗性由位置34处的额外aib残基和位置29处的d-丙氨酸残基赋予；在雷曲肽中，aib-20有助于最佳的gipr活化，13位的α-甲基-l-亮氨酸促进gcgr和gipr活化；在pemvidutide中，通过glu-16和lys-20之间的内酰胺形成来稳定α-螺旋二级结构也有助于延长该制剂的半衰期(参见j.j.nestor,d.parkes,m.feigh,j.j.suschak,m.s.harris.effects of alt-801,a glp-1and glucagon receptor dual agonist,in a translational mouse modelof non-alcoholic steatohepatitis.sci.rep.,12(2022),p.6666)。

6、本发明中的第三方面提供了一种治疗糖尿病的药物组合物，包括所述的降血糖肽ms-78d，和/或如所述的降血糖肽ms-78d的衍生物。

7、进一步的，药物组合物为注射剂或粉针剂。

8、本发明中的第四方面提供了所述的降血糖肽ms-78d，和/或所述的降血糖肽ms-78d的衍生物在制备治疗糖尿病药物中的应用。

9、进一步的，所述糖尿病为i型糖尿病或ii型糖尿病。

10、有益效果

11、本发明提供了一种从苦瓜中提取的多肽及其用于将血糖的用途，所述多肽具有降低血糖作用，为一种具有新型氨基酸结构的降血糖肽，能够有效降低空腹血糖；本发明在该降血糖肽的基础上，对其氨基酸序列进行了改造，使用非天然氨基酸进行替换，提高肽链的稳定性，从而改善了降血糖能力以及免疫调节能力，促进胰岛素分泌，为开发治疗糖尿病的药物提供新的方向。