一种治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物的制作方法

一、本发明涉及医学与化学工程学领域，特别是一种治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物。

背景技术：

0、二、背景技术

1、nafld被视为代谢综合征的肝脏表现，其特征是肝脂肪变性，可进展为肝纤维化和肝硬化，通常与代谢危险因素相关，包括肥胖、血脂异常、高血压和糖尿病。nafld正在成为全球主要的慢性肝病，并给全球经济带来了巨大的负担。非酒精性脂肪肝病因复杂，缺乏有效药物治疗，目前可通过改变生活方式和药物等改善nafld，尽管已经投入了巨大的努力和精力来对抗nafld，但是其相关疾病的病例持续增加，因此，非常需要用于治疗nafld及相关疾病的新药物和策略。

2、肠道微生物群被认为是调节宿主健康的关键因素之一,与许多疾病有关，包括肥胖、2型糖尿病、肠道疾病和癌症等。在t2d中，微生物变化与胰岛素抵抗的存在密切相关，多项研究表明肠道微生物组影响葡萄糖调节。在肠道疾病中，肠道菌群失衡不仅能导致溃疡性结肠炎的发生，其失调的严重程度还直接影响了病情的发展速度。越来越多的证据表明，肝脏与肠道之间有着紧密的结构及功能关系，即“肠-肝轴”，肠道微生物通过肝轴在nafld中发挥了作用，特别是在纤维化和向更晚期疾病发展的病例中。益生菌作为肠道菌群的一类能够给宿主带来较为可观益处，能够调节血糖代谢、维持肠道菌群平衡、改善乳糖不耐受、增强免疫功能等特点。具体来说，lactobacillus plantarum ps128已被证明可通过抑制mptp诱导的神经胶质细胞过度活化，增加纹状体中的去甲肾上腺素及神经营养因子，抑制黑质纹状体通路的氧化应激及神经炎症进而缓解帕金森。类似的，a.muciniphila(atcc-baa-835)的分泌物p9蛋白与其配体icam-2结合后，能够激活glucagon-like peptide-1(glp-1)受体信号通路，通过促进机体产热从而改善hfd小鼠肥胖症和被破坏的葡萄糖稳态。bacteroides xylanisolvens通过nicx降解肠道尼古丁，有效缓解吸烟加重的nash进展。

3、胆汁酸(bas)是一组由肝细胞中的胆固醇合成的两亲性分子，释放到肠道中，并由肠道微生物群进一步代谢和修饰。bas的合成包括经典途径和替代途径两种生物合成途径，“经典”途径通过cyp7a1、cyp8b1和cyp27a1三种胆固醇羟化酶的酶促作用产生胆酸和鹅去氧胆酸，主要生成12羟胆汁酸。“替代”途径通过cyp27a1对胆固醇侧链的羟基化，然后再通过cyp7b1对27-羟基胆固醇和其他氧甾醇的7α-羟基化合成，主要产生非12-oh bas。bas由初级bas和次级bas组成，初级bas由肝细胞合成并储存在胆囊中，经肠道菌群的生物转化反应，生成次级胆汁酸(sbas)，进而为微生物和宿主互作产生的内源性物质。研究发现肠道菌群、胆汁酸和宿主之间的相互作用影响了免疫功能、代谢表型和许多疾病的风险因素，这些疾病包括肥胖症、糖尿病、非酒精性脂肪肝、炎症性肠病(ibd)和各类癌症。ba的调节作用是通过激活特定的受体介导的，包括核受体超家族成员法尼醇x受体(fxr)、组成性雄甾烷受体、维生素d受体和孕烷x受体以及g蛋白偶联受体超家族(tgr5)。在这些受体中，fxr在肝细胞和肠细胞中含量丰富，是调节肝脏和肠道中关于ba合成相关基因表达的最重要受体。fxr激活可通过胆汁酸依赖的方式降低脂质吸收从而预防nafld。

4、聚多巴胺(pda)是一种受贻贝中粘附蛋白启发的合成材料，由于其儿茶酚基团的强粘附性，已被广泛用作各种表面的涂层。多巴胺的聚合发生在细胞相容性条件下，在聚多巴胺表面培养的哺乳动物细胞，例如成纤维细胞、成骨细胞、神经元和内皮细胞均显示出正常的增殖而没有细胞毒性。此外pda可以在酸性条件下缓慢溶解，使其成为ph值控制的药物递送平台的理想材料。

5、益生菌在治疗代谢性疾病已取得重大突破，但其在口服给药期间表现出较差的稳定性和对胃肠环境压力(如胃酸)的高度敏感性，导致益生菌的数量和活性下降，这将使最终定居在肠道中的活益生菌数量低于发挥有益效果的理论最低阈值。此外，由于益生菌对肠壁的粘附性较差，细菌定殖功效较低，这将进一步影响治疗效果。因此，保持高存活率和高效的肠道定殖对于益生菌在宿主体内发挥有效功能至关重要。目前，有多种方法可使益生菌在口服给药期间具有存活和茁壮成长的能力，并具有改善的肠道定居功效，如挤压、冷冻干燥、喷雾干燥和微囊化。尽管使用这些方法有一定程度的改善，但复杂的操作、低产率和对益生菌的机械损伤是不可避免的。因此，迫切需要开发一种简单而有效的方法来增强益生菌抵抗胃肠道环境应激的能力，并延长益生菌在肠道中的滞留时间，以更好地发挥其在体内的作用。

技术实现思路

0、三、
技术实现要素：

1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，可有效利用活菌复合物调节肠道菌群及其代谢产物治疗非酒精性脂肪肝。

2、本发明解决的技术方案是，采用医学与化学工程学相结合的手段，基于共沉淀聚合技术将聚合物与益生菌结合，构建pg@pda，具体是，将古氏副拟杆菌在35-40℃哥伦比亚血平板琼脂培养基上培养3-4天，然后从哥伦比亚血平板琼脂培养基上挑取菌落，在bd厌氧瓶中培养8-12h，将5-15ml活菌含量为5.0×108cfu/ml的古氏副拟杆菌菌液以4500×rpm离心3min，然后将菌体加入到5-15ml含5-15mg多巴胺的10mm tris-hcl缓冲液(ph 8.5)中，混匀，室温避光搅拌20-30min，用pbs洗涤2-3次进行纯化，即得活菌复合物(pg@pda)。

3、所述的哥伦比亚血平板培养基组成：特殊蛋白胨23.0g/l、淀粉1.0g/l、氯化钠5.0g/l、琼脂10.0g/l、脱纤维绵羊血50-70ml、蒸馏水1l，ph7.3±0.2，25℃。

4、本发明活菌复合物能够帮助细菌抵抗体内复杂的环境，减少细菌死亡率，与裸露的细菌相比，pg@pda在肠道中存活率较其明显增高，同时，pg@pda还能够辅助细菌增加肠道菌群的多样性，此外，在灌胃pg@pda后，一些与细菌相关的代谢产物hyodeoxycholic acid(hdca)、lithocholic acid(lca)、isolithocholic acid(isolca)和apoca，明显上升，并激活fxr受体，进而使shp基因表达增加，减少肝脏脂质的移位沉积，证明了pg@pda能够减轻高脂饮食诱导的nafld。此外，共沉淀聚合技术装饰细菌可以增强治疗效果，为开发用于代谢性疾病的新疗法提供了新的思路。

技术特征：

1.一种治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，其特征在于，将古氏副拟杆菌在35-40℃哥伦比亚血平板琼脂培养基上培养3-4天，然后从哥伦比亚血平板琼脂培养基上挑取菌落，在bd厌氧瓶中培养8-12h，将5-15ml活菌含量为5.0×108cfu/ml的古氏副拟杆菌菌液以4500×rpm离心3min，然后将菌体加入到5-15ml含5-15mg多巴胺的10mm tris - hcl缓冲液中，混匀，室温避光搅拌20-30min，用pbs洗涤2-3次进行纯化，即得活菌复合物。

2.根据权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，其特征在于，将古氏副拟杆菌在35℃哥伦比亚血平板琼脂培养基上培养3天，然后从哥伦比亚血平板琼脂培养基上挑取菌落，在bd厌氧瓶中培养8h，将5ml活菌含量为5.0×108cfu/ml的古氏副拟杆菌菌液以4500×rpm离心3min，然后将菌体加入到5ml含5mg多巴胺的10mm tris - hcl缓冲液中，混匀，室温避光搅拌20min，用pbs洗涤2次进行纯化，即得活菌复合物。

3.根据权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，其特征在于，将古氏副拟杆菌在37℃哥伦比亚血平板琼脂培养基上培养4天，然后从哥伦比亚血平板琼脂培养基上挑取菌落，在bd厌氧瓶中培养10h，将10ml活菌含量为5.0×108cfu/ml的古氏副拟杆菌菌液以4500×rpm离心3min，然后将菌体加入到10ml含10 mg多巴胺的10mm tris - hcl缓冲液中，混匀，室温避光搅拌30min，用pbs洗涤3次进行纯化，即得活菌复合物。

4.根据权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，其特征在于，将古氏副拟杆菌在40℃哥伦比亚血平板琼脂培养基上培养4天，然后从哥伦比亚血平板琼脂培养基上挑取菌落，在bd厌氧瓶中培养12h，将15ml活菌含量为5.0×108cfu/ml的古氏副拟杆菌菌液以4500×rpm离心3min，然后将菌体加入到15ml含15mg多巴胺的10mm tris - hcl缓冲液中，混匀，室温避光搅拌30min，用pbs洗涤3次进行纯化，即得活菌复合物。

5.根据权利要求1所述的治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，其特征在于，所述的哥伦比亚血平板培养基组成：特殊蛋白胨23.0g/l、淀粉1.0 g/l、氯化钠5.0 g/l、琼脂10.0 g/l、脱纤维绵羊血50-70ml、蒸馏水1l，ph7.3±0.2，25℃。

技术总结
本发明涉及治疗非酒精性脂肪肝的活菌复合物，可有效利用活菌复合物调节肠道菌群及其代谢产物治疗非酒精性脂肪肝，其解决的技术方案是，采用医学与化学工程学相结合的手段，基于共沉淀聚合技术将聚合物与益生菌结合，构建PG@PDA，本发明活菌复合物能够帮助细菌抵抗体内复杂的环境，减少细菌死亡率，与裸露的细菌相比，PG@PDA在肠道中存活率较其明显增高，同时，PG@PDA还能够辅助细菌增加肠道菌群的多样性，并激活FXR受体，进而使SHP基因表达增加，减少肝脏脂质的移位沉积，此外，共沉淀聚合技术装饰细菌可以增强治疗效果，为开发用于代谢性疾病的新疗法提供了新的思路。

技术研发人员：袁慧娟,王秀丹,田瑞,韦伟,李莉,吕英华
受保护的技术使用者：河南省人民医院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4