靶向Siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用

本申请涉及生物医学，更具体地涉及一种靶向siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术：

1、免疫治疗是应用免疫学原理和方法，通过主动或被动方式激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，杀伤肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的治疗方法，在多种癌症的治疗中展现出了良好的治疗效果。免疫治疗包括过继性免疫细胞治疗、细胞因子疗法、免疫检查点阻断疗法以及肿瘤疫苗等。其中，免疫检查点阻断疗法因其显著疗效而备受瞩目。

2、免疫检查点是机体自身免疫和抗肿瘤作用之间维持平衡的一系列重要因子，在维持自身免疫耐受和机体免疫稳态中起关键作用。细胞毒性t淋巴细胞抗原(ctla-4)和pd-1是最早发现的免疫检查点之一。ctla-4与共刺激受体cd28高度同源，竞争性地与共同配体cd80/cd86结合，中断了cd28刺激t细胞的活化反应并传递免疫抑制信号。pd-1与pd-l1结合后会促进shp2磷酸酶的募集，再通过下游信号通路抑制tcr介导的t细胞增殖和细胞因子的分泌。目前发现的免疫检查点还有t细胞免疫球蛋白黏液素3(tim-3)、淋巴细胞激活基因-3(lag-3)等。

3、为了逃避免疫系统的监视，癌细胞在增殖过程中会通过异常激活免疫检查点来抑制免疫系统的活性，这与肿瘤的免疫逃逸有关。如肿瘤细胞表面高表达的pd-l1与t细胞表面的pd-1结合后会抑制t细胞的活性。在晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌的临床试验中，pd-1/pd-l1抗体药物(纳武单抗、派姆单抗等)已取得了良好的药物反应率和反应持久度。尽管免疫检查点阻断疗法已成为最成功的癌症治疗方法之一，但在实体瘤中仍面临耐药性和治疗毒性等诸多障碍。实际上，pd-1/pd-l1抗体药物对实体瘤总体只有20％～30％的有效率。因此，继续寻找新的免疫检查点及开发相应的抑制性抗体成为了目前肿瘤治疗的主要目标之一。

4、唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglec)家族可通过识别含有唾液酸的糖链来介导不同细胞之间的相互作用，这与细胞的活化有关，此外siglecs在自身免疫病和肿瘤的生长中具有发挥重要调控的作用。在大多数人正常的组织和免疫细胞中，siglec-15的mrna的表达量很低，主要在巨噬细胞上表达，但在多种人的癌细胞中其表达量会上升(如结肠癌和肝癌等)。siglec-15在体外可有效抑制t细胞的活性，这意味着肿瘤可通过siglec-15这一免疫检查点来实现免疫逃逸。遗憾的是，siglec-15在t细胞上的受体至今仍是未知的。目前市面上的siglec-15抗体主要以多克隆抗体为主，特异性不强，因此，研制一种新的特异性强、亲和力高的siglec-15单克隆抗体，对于后续siglec-15抗体药物及用于相应检测方法的开发具有重要意义。

技术实现思路

1、鉴于上述问题，本申请提供了一种靶向siglec-15的单克隆抗体、制备方法及其应用，该单克隆抗体能与人的siglec-15蛋白特异性结合，以期为后续抗体药物和相应检测方法的研发提供新的选择。

2、为实现上述目的，本发明的第一个方面，发明人提供了一种靶向siglec-15的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含vhcdr3和vlcdr3，其中，所述vhcdr3的氨基酸序列如seq idno:1所示，所述vlcdr3的氨基酸序列如seq id no:2所示。

3、优选地，所述vhcdr3的编码dna序列如seq id no.3所示，所述vlcdr3的编码dna序列如seq id no.4所示。

4、优选地，所述单克隆抗体特异性识别人的siglec-15蛋白。

5、优选地，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

6、本发明的第二个方面，发明人提供了一种组合物，该组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

7、本发明的第三个方面，发明人提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物以本发明第一方面所述的单克隆抗体为载体制备而成。

8、本发明的第四个方面，发明人提供了一种检测试剂盒，该检测试剂盒中包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

9、本发明的第五个方面，发明人提供了一种生产如本发明第一方面所述的单克隆抗体的细胞。

10、本发明的第六个方面，发明人还提供了一种本发明第一方面所述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

11、s1、构建人的siglec-15胞外区蛋白h-siglec-15的表达载体，表达纯化，得到人的胞外区蛋白h-siglec-15；

12、s2、将所述人的胞外区蛋白h-siglec-15作为抗原免疫兔子，分离出兔pbmc中的单个b细胞，调取所述b细胞中抗体的轻重链可变区片段；

13、s3、将所述b细胞中抗体的轻重链可变区片段构建至含有兔轻重链恒定区的轻重链表达载体上，表达兔单克隆抗体；

14、s4、筛选特异性最高的兔单克隆抗体，即为所述新的靶向siglec-15的单克隆抗体。

15、在本发明优选的实施方式中，s2步骤中为采用巢式pcr的方法调取所述b细胞中抗体的轻重链可变区片段。巢式pcr的方法调取可提高扩增出来的产物量，而且可以避免产生突变。

16、区别于现有技术，上述技术方案至少有以下有益效果：

17、1、提供了一种靶向siglec-15的单克隆抗体，相较于现有技术中靶向siglec-15的多克隆抗体而言，特异性更强、亲和力更好；

18、2、提供了一种新的靶向人的siglec-15蛋白的单克隆抗体，有望在未来开发出靶向性强、疗效好以及副作用小的抗肿瘤药物，为免疫检查点阻断疗法提供新的途径；

19、3、用单个b细胞抗体制备技术来制备siglec-15单克隆抗体。在使用expi293真核表达系统表达纯化出人的siglec-15胞外区蛋白后，将其作为抗原来免疫兔子。免疫3次后分离出兔pbmc中的单个b细胞，再用巢式pcr的方法调取b细胞中抗体的轻重链可变区片段。接着，进一步成功克隆出19株siglec-15兔单克隆抗体，并对其中特异性最高的抗体进行了一系列功能活性鉴定，结果显示这株抗体在western blotting、elisa、flow cyto metry(fcm)和immunofluorescence(if)中均可识别与结合人的siglec-15蛋白，并且在wb中识别人siglec-15蛋白的能力方面，与商业化的多克隆抗体相比具有更强的特异性。

技术特征：

1.一种靶向siglec-15的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包含vhcdr3和vlcdr3，其中，所述vhcdr3的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述vlcdr3的氨基酸序列如seq id no:2所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述vhcdr3的编码dna序列如seqid no.3所示，所述vlcdr3的编码dna序列如seq id no.4所示。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别人的siglec-15蛋白。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为兔单克隆抗体。

5.一种组合物，其特征在于，包含权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体。

6.一种抗体偶联物，其特征在于，以权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体为载体制备而成。

7.一种检测试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体。

8.一种生产如权利要求1-4任一项所述的单克隆抗体的细胞。

9.如权利要求1-4中任一项所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，s2步骤中为采用巢式pcr的方法调取所述b细胞中抗体的轻重链可变区片段。

技术总结
本申请涉及生物医学技术领域，更具体地涉及一种靶向Siglec‑15的单克隆抗体、制备方法及其应用。本发明提供了一种新的靶向Siglec‑15的单克隆抗体，相较于现有技术中靶向Siglec‑15的多克隆抗体而言，特异性更强、亲和力更好。该单克隆抗体为靶向人的Siglec‑15蛋白的单克隆抗体，有望在未来开发出靶向性强、疗效好以及副作用小的抗肿瘤药物，为免疫检查点阻断疗法提供新的途径。本发明提供的靶向Siglec‑15的单克隆抗体26H4在WB中识别人Siglec‑15蛋白的能力方面，与商业化的多克隆抗体相比具有更强的特异性。

技术研发人员：傅雅娟,陈骐,苏敏存
受保护的技术使用者：福建师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4