一种人源IgA抗体重链表达质粒及应用

本发明公开了一种质粒，属于核酸分子。

背景技术：

1、抗体（antibody, ab）是介导体液免疫的重要效应分子，是免疫系统在抗原刺激下，由b细胞或记忆b细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin, ig），主要分布在血清中，也分布于组织液、外分泌液及某些细胞膜表面。抗体重链分子量约为50~75 kda，由450~550个氨基酸残基组成，根据重链恒定区的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同的重链与轻链组成完整的抗体分子，分别被称为igm、igg、iga、igd和ige。

2、iga有血清型和分泌型两种。血清型为单体，主要存在于血清中，占血清免疫球蛋白总量的10%~15%。分泌型iga（secretory iga, siga）为二聚体，由j链连接，含分泌成分（secretory component, sc），经黏膜上皮细胞分泌至外分泌液中。siga合成和分泌的部位主要在肠道、呼吸道、乳腺、唾液腺和泪腺，主要存在于胃肠道和支气管分泌液、初乳、唾液和泪液中。siga是外分泌液中的主要抗体类别，参与黏膜局部免疫，通过与相应病原微生物结合，阻止病原体黏附到细胞表面，从而在局部抗感染中发挥重要作用，是机体抗感染的“边防军”。siga在黏膜表面也有中和毒素的作用。新生儿易患呼吸道、胃肠道感染可能与iga合成不足有关。婴儿可从母亲初乳中获得siga，是重要的自然被动免疫。

3、人体中，iga分为iga1和iga2两种亚型，血清型iga大约90%为iga1亚型，10%为iga2亚型，分泌型iga两种亚型的分布比例取决于不同的黏膜部位，iga1常见于鼻、支气管、胃和小肠黏膜，iga2主要存在于大肠和女性生殖道。iga1的铰链区比iga2的铰链区长，此外，iga1和iga2的糖基化水平也有差异，两种亚型的iga均有正在开展的临床前研究。

4、2022年全球抗体药物市场规模达到2200亿美元，得益于至少125款抗体药物的销售贡献，适应症覆盖自身免疫性疾病、肿瘤、感染性疾病等领域。人工制备抗体是大量获得抗体的有效途径，随着分子生物学的发展，人们已可通过抗体工程技术制备基因工程抗体。抗体发现策略从杂交瘤技术，到噬菌体文库技术，到转基因鼠技术再到现在的单细胞pcr技术、单细胞测序技术，可获得天然配对的全人源抗体基因。现有的抗体治疗药物主要为igg型，近年来，iga作为一种新型的治疗性抗体受到越来越多的关注。尽管目前未有获批上市的iga药物，但是很多临床前研究表明，iga在黏膜抗感染、自身免疫疾病等领域展现出巨大的应用潜力，有望成为新的治疗手段。构建人源iga抗体重链表达质粒为治疗性iga药物的研究提供了快速便捷的方法。

5、本发明的目的是提供一种可以便捷、快速克隆表达人源iga抗体重链的质粒，进而提供以所述质粒表达人源iga抗体重链的方法。

技术实现思路

1、基于上述目的，本发明首先提供了一种人源iga抗体重链表达质粒，在所述人源iga抗体重链表达质粒依次含有抗生素抗性筛选基因、cmv启动子，携带kozak序列元件和抗体重链信号肽的抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区、转录后调节序列、polya尾，其中，在所述抗体先导序列元件的下游设置有 hpa i酶切位点，在重链恒定区的上游设置 ecorv酶切位点，所述连接元件位于 hpa i酶切位点和 ecor  v酶切位点之间，所述人源iga抗体重链表达质粒经 hpa i和 ecor  v双酶切致所述连接元件被去除后两个线性化末端用于分别与拟表达的人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂和人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂进行同源重组，所述人源iga抗体重链可变区编码基因5’端同源重组臂序列如seq id no.13 所示，所述人源iga抗体重链可变区编码基因3’端同源重组臂如seq id no.14 所示，所述抗体先导序列元件的序列如seq id no.4所示。

2、在一个优选的实施方案中，所述重链恒定区编码基因如seq id no.1 所示或如seq id no.2 所示。所述seq id no.1为iga1型的重链序列，具有该序列的人源iga抗体重链表达质粒被命名为：pab-igha1；所述seq id no.2为iga2型的重链序列，具有该序列的人源iga抗体重链表达质粒被命名为：pab-igha2。

3、在另一个优选的实施方案中，在所述重链恒定区和转录后调节序列之间设置有多克隆位点，所述多克隆位点的序列如seq id no.7所示。

4、在又一个优选的实施方案中，转录后调节序列为土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列（genbank: mq208857.1）。

5、在一个优选的实施方案中，所述抗生素抗性筛选基因为氨苄青霉素抗性筛选基因。

6、在另一个优选的实施方案中，所述连接元件的序列如seq id no.5所示，在本发明中所述连接元件的设计用于酶切载体之前将抗体先导序列元件与重链恒定区连接保持质粒环形化，酶切后所述连接元件被释放，并回收线性化质粒回收。因此，连接元件的具体序列内容与本发明的人源iga抗体重链表达质粒的应用功能无关，只要能够履行上述功能的dna片段均可以作为本发明的连接元件使用。

7、其次，本发明提供了上述的人源iga抗体重链表达质粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

8、（1）构建含有抗生素抗性筛选基因、cmv启动子、转录后调节序列、polya尾和多克隆位点的真核细胞表达载体，所述真核细胞表达载体在本发明中被命名为pab；其中，在所述cmv启动子的下游设置 ecor i酶切位点，在转录后调节序列的上游设置 not i酶切位点，所述真核细胞表达载体经 ecor i和 not i双酶切后两个线性化末端用于同源重组；

9、（2）构建含有5’端同源重组臂、抗体先导序列元件，连接元件，重链恒定区和3’端同源重组臂的线性片段，其中，5’端同源重组臂中含有 ecor i酶切位点，3’端同源重组臂中含有 not i酶切位点，在所述抗体先导序列元件的下游设置有 hpa i酶切位点，在重链恒定区的上游设置 ecor  v酶切位点；

10、（3）使用 ecor i和 not i将步骤（1）获得的真核细胞表达载体双酶切，获得双酶切线性化载体，所述双酶切线性化载体用于同源重组；

11、（4）将步骤（3）双酶切获得的线性化载体和（2）构建的线性片段进行同源重组，获得所述的人源iga抗体重链表达质粒。

12、在一个优选的实施方案中，步骤（2）中所述5’端同源重组臂的序列如seq id no.3所示，所述3’端同源重组臂的序列如seq id no.6 所示。

13、在一个更为优选的实施方案中，步骤（2）中所述线性片段的如seq id no. 8所示，所述片段在本发明中被命名为igha1，或如seq id no. 9 所示，所述片段在本发明中被命名为igha2。

14、在本发明的一个具体实施方案中，步骤（1）所述的真核细胞表达质粒pab是以商业化载体pcdna3.4 topo为出发载体构建的。其中，使用 xba i和 ecor v双酶切pcdna3.4 topo后，将合成的包含 ecor i、 not i等酶切位点的序列如seq id no.16的同源重组序列通过同源重组插入线性化的pcdna3.4 topo载体，得到真核细胞表达质粒pab。

15、在本发明的一个具体实施方案中，所述质粒pab包含：(1)人巨细胞病毒早期启动子元件(cmv)，是众多哺乳动物细胞中启动表达的较强启动子，有很广泛的宿主适用范围，其中包括中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary，cho)；(2)土拨鼠肝炎病毒转录后调节序列(wpre)，是增强表达的元件，可以增加外源片段的表达效率；(3)多聚a尾基因(polya)，有助mrna从核到细胞质转运以及避免mrna在细胞中受到核酶降解，增强mrna的稳定性；（4）氨苄抗性基因，在含有氨苄抗生素的lb平板上，成功转化的阳性细菌克隆能够生长。质粒pab去除了pcdna3.4 topo载体原有的 ecor v酶切位点，便于后续载体构建。

16、又次，本发明提供了一种应用上述的人源iga抗体重链表达质粒制备人源iga抗体重链的方法，所述方法包括以下步骤：

17、（1）使用 hpa i和 ecor  v将所述的人源iga抗体重链表达质粒双酶切获得线性化质粒；

18、（2）构建拟表达的人源iga抗体的重链可变区线性片段，其中，在所述重链可变区线性片段的5’端设置有与步骤（1）获得的线性化质粒 hpa i酶切端发生同源重组的5’端同源重组臂，在所述重链可变区线性片段的3’端设置有与步骤（1）获得的线性化质粒 ecor  v酶切端发生同源重组的3’端同源重组臂；

19、（3）使步骤（1）获得的线性化质粒与步骤（2）获得的重链可变区线性片段进行同源重组获得含有拟表达人源iga抗体的重链可变区的人源iga抗体重链表达质粒；

20、（4）表达步骤（3）获得的人源iga抗体重链表达质粒，并回收表达产物。

21、在本发明的一个优选实施方案中，通过pcr扩增构建步骤（2）所述的人源iga抗体的重链可变区线性片段，其中，在所述pcr扩增的上游引物设置为5’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，在所述pcr扩增的下游引物设置为3’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，所述pcr扩增的上游引物的5’端的同源重组臂的序列如seq id no.13 所示，所述pcr扩增的下游引物的5’端的同源重组臂的序列如seqid no.14所示。

22、所述5’端同源重组臂序列的3’端的6位碱基（cagtgt）为引物中添加的，用于补齐因为 hpa i酶切所述人源iga抗体重链表达质粒导致缺失的抗体前导序列的6位碱基；所述3’端同源重组臂序列的3’端的两位碱基（gc）为引物中添加的，用于补齐前述的因为ecor v酶切所述人源iga抗体重链表达质粒导致缺失的抗体恒定区起始的两位碱基。

23、在本发明的一个制备抗新冠病毒s蛋白抗体zw2g10（cn 114031685a）的具体方法中，用于扩增抗体zw2g10的重链可变区的上游引物的序列如seq id no.10所示，用于扩增抗体zw2g10的重链可变区的下游引物的序列如seq id no.11所示。

24、最后，本发明提供了一种制备人源iga抗体重链的试剂盒，所述试剂盒包括：

25、（1）上述的人源iga抗体重链表达质粒；

26、（2）用于pcr扩增人源iga抗体重链可变区的上游引物和下游引物，其中，在所述pcr扩增的上游引物由5’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，在所述pcr扩增的下游引物设置为3’端同源重组臂与重链可变区特异结合区两个区段串联而成，所述pcr扩增的上游引物的5’端的同源重组臂的序列如seq id no.13 所示，所述pcr扩增的下游引物的5’端的同源重组臂的序列如seq id no.14所示

27、（3）用于使（1）所述的人源iga抗体重链表达质粒和（2）所述的人源iga抗体重链可变区发生同源重组的试剂，用于同源重组的试剂为本领域常规的同源重组试剂即可满足本发明的同源重组实施。

28、在本发明提供的一个制备抗新冠病毒s蛋白抗体zw2g10（cn 114031685a）的具体试剂盒中，用于扩增抗体zw2g10的重链可变区的上游引物的序列如seq id no.10所示，用于扩增抗体zw2g10的重链可变区的下游引物的序列如seq id no.11所示。

29、本发明构建了一种人源iga抗体重链表达质粒，本发明通过设计同义突变在所述人源iga抗体重链表达质粒中引入 hpai和 ecorv酶切位点，可以在不改变抗体重链可变区序列的基础上将抗体可变区插入igha载体，适用于所有人源抗体的重链可变区的载体构建，同时用于扩增抗体可变区的引物中的同源臂也是本发明的核心发明点。

30、相比传统的方法，本发明提供的载体及制备人源iga抗体重链的方法在以下方案取得了优异的技术效果：

31、1. 省时：信号肽和恒定区直接构建在载体上，不需要进行重叠延伸pcr获得全长抗体基因过程，有效避免pcr过程导致的序列突变问题。

32、2. 高通量：通过单细胞pcr技术或者单细胞测序技术获得的抗体可变区序列可直接通过96孔板进行回收，通过同源重组连接到双酶切后的载体上。

33、3. 简便：同源重组后的菌落无需进行克隆pcr鉴定，直接选取菌落进行序列测定确认，正确率大于90%。

34、4. 适用范围广，本发明提供的载体可用于所有人源抗体的重链可变区的iga型抗体表达载体的构建，是一种通用型的人源iga抗体重链表达载体。