一种pagA重组蛋白及其制备方法与流程

本发明涉及生物，尤其是涉及一种paga重组蛋白及其制备方法。

背景技术：

1、炭疽毒素是炭疽杆菌的关键性致病因子，由保护性抗原(protective antigen，pa)、水肿因子(edema factor，ef)、致死因子(lethal factor，lf)三种毒素因子组成，pa与宿主细胞表面的炭疽毒素受体结合经一系列的相互作用后，lf/ef被pa输送进宿主细胞细胞质中，从而发挥各自的毒素效应。

2、lfn（致死因子氨基末端结构域）由lf氨基端的前254aa组成，不含有lf的毒性区域，与pa具有很高的亲和结合力。基于炭疽毒素的分子结构和作用机制发展的pa/lfn转运系统，具有转运外源蛋白到胞质中的作用。当pa与lfn同时存在时，pa会和细胞表面受体结合，并与lfn形成多聚体，从而将lfn转运入细胞。pa蛋白与宿主细胞表面的受体结合，形成pa-受体复合物，pa-受体复合物会通过内吞作用进入宿主细胞内部，形成一个内吞体，内吞体会与细胞内液泡融合，形成一个通道，通过该通道释放pa蛋白，释放出的pa蛋白能够与细胞膜上的受体结合，引发一个剪切活化过程，将lfn从pa蛋白中释放出来，发挥毒性。

3、pa能够介导lfn-protein融合蛋白易位到细胞质中，激起机体的特异性免疫应答，在机体的抗病毒及抗肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。目前pa蛋白基本由实验室自行制备，而课题组前期通过查询炭疽杆菌paga的基因序列（序列如seq id no.4所示）直接制备pa蛋白未成功获得pa蛋白，即使对表达方法进行优化也未成功获得pa蛋白。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的上述不足，采用重组蛋白工程技术制备一种paga重组蛋白。本发明提供了一种paga重组蛋白的制备方法。具体是将优化后的paga基因序列插入到表达载体中，然后转化到宿主细胞中进行表达，通过优化表达系统和调控表达条件，获得纯净的、高产量的paga蛋白。

2、本发明的第一个目的是提供一种编码paga蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明的第二个目的是提供携带所述基因的重组质粒。

4、在一种实施方式中，所述重组质粒以pet系列载体为表达载体。

5、本发明的第三个目的是提供携带所述基因或所述重组质粒的重组细胞。

6、在一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或毕赤酵母为宿主。

7、本发明还提供了一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌表达了所述基因。

8、在本发明的一种实施方式中，所述重组大肠杆菌为，以pet-28a(+)为载体，在大肠杆菌bl21(de3)中表达seq id no.2所示的paga基因。

9、本发明还提供了一种制备paga蛋白的方法，所述方法为将所述重组细胞或所述重组大肠杆菌接种于含有碳源的反应体系中进行诱导表达，收集发酵液，纯化获得paga蛋白。

10、在一种实施方式中，所述诱导表达的条件为在18~20℃以下诱导表达3~5h。

11、在一种实施方式中，所述诱导表达的诱导剂为20~200 μm的iptg。

12、本发明还提供了所述基因，或所述重组质粒，或所述重组细胞，或所述重组大肠杆菌在生产制备paga蛋白中的应用。

13、本发明的有益效果：

14、本发明以氨基酸序列为seq id no.1所示的paga蛋白为基础，优化得到了炭疽杆菌paga的核苷酸序列（seq id no.2），设计合成带有8×his纯化标签的paga基因（seq idno.3），无需开发特异性亲和配体即可完成蛋白的亲和层析蛋白纯化，成功实现了paga蛋白的表达和纯化。采用本发明提供的重组蛋白工程技术制备的paga蛋白，纯度较好，浓度为0.9 mg/ml (20mm pb缓冲液，ph 8.0)，本发明克服了paga蛋白表达和纯化困难的问题。

技术特征：

1.一种编码paga蛋白的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.携带权利要求1所述基因的重组质粒。

3.携带权利要求1所述基因或权利要求2所述重组质粒的重组细胞。

4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或毕赤酵母为宿主。

5.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌表达了权利要求1所述基因。

6.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以pet-28a(+)为载体，在大肠杆菌bl21(de3)中表达权利要求1所述基因。

7.一种制备paga蛋白的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求3或4所述重组细胞，或权利要求5或6所述重组大肠杆菌接种于含有碳源的反应体系中进行诱导表达，收集培养液，纯化获得paga蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为在18~20℃以下诱导表达3~5h。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的诱导剂为20~200 μm的iptg。

10.权利要求1所述基因，或权利要求2所述重组质粒，或权利要求3或4所述重组细胞，或权利要求5或6所述重组大肠杆菌在生产制备paga蛋白中的应用。

技术总结
本发明公开了一种pagA重组蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。本发明提供一种用于制备pagA重组蛋白的核酸序列，其包括pagA全长序列和His标签序列。本发明还提供了一种pagA重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：（1）用引物P1和P2对pagA进行PCR扩增；（2）将PCR产物与PET28a载体经NcoI和XhoI酶切后通过重组酶连接、转化、测序鉴定重组子；（3）将重组子转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中进行诱导培养；（4）纯化、复性得到pagA重组蛋白。本发明pagA重组蛋白的制备流程简单、产量较高、易于重复，适合大规模生产，且产物纯净。

技术研发人员：蒋卉,杨军,刘新梅,胡文彦,余金烨
受保护的技术使用者：南京市食品药品监督检验院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15