一种基于LSDV噬菌体展示文库筛选的蛋白质及其应用

本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于牛结节性皮肤病病毒(lumpy skindisease virus，lsdv)噬菌体展示文库筛选获得的抗原蛋白，本发明还涉及该蛋白的制备方法及其应用，尤其是在lsdv病毒检测中的应用。

背景技术：

1、牛养殖业是我国畜牧业的重要组成部分，近年来，随着人们生活水平的提高，牛肉和牛奶的需求量不断增加。随着国际、国内牛产品和活牛贸易量的增加、规模化养牛水平提高以及自然等因素，牛病毒性传染病对养殖业以及公共卫生安全的影响日益严重。因此，对牛病毒性传染病的及时诊断和预防十分重要。

2、疫苗是控制传染性疾病的有效措施。虽然目前有一些牛常见传染病的疫苗已经用于生产实践，但是依旧有一些病毒性传染病缺乏疫苗，再加之有些病毒存在多个亚型或毒株以及毒株不断发生变异等原因，也使得一些疫苗免疫失败或者无法对动物产生交叉保护。除此之外，加快特异性诊断靶标研发，及时发现病原并控制病原的传播，这对预防传染性疾病的爆发至关重要。基于此，申请人建立了展示全球以牛亚科动物为宿主的已知所有病毒的噬菌体文库，并利用病毒感染后的牛阳性血清，采用噬菌体免疫共沉淀技术，对所有已知牛病毒进行全基因组扫描，鉴定新抗原以及已知抗原的高免疫原性区域或表位，以为新型疫苗研发和开发特异性的诊断试剂等提供新的抗原靶标。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用lsdv噬菌体展示文库高通量、无偏见筛选到的lsdv抗原蛋白，并进一步提供该抗原蛋白的制备方法及其应用，旨在为特异性诊断试剂的开发提供新的抗原靶标。

2、为了实现上述目的，本发明首先构建了展示lsdv的噬菌体文库，接着利用感染了lsdv的阳性血清对文库进行噬菌体免疫共沉淀筛选，通过二代测序以及数据分析，从文库中筛选出lsdv的抗原肽段。

3、具体而言，所述抗原蛋白的筛选方法如下：

4、1)从ncbi virus中搜索lsdv，一共搜索到29株核苷酸序列，包含4522条蛋白序列，将蛋白序列切割为56个氨基酸的肽段并去冗余后一共有1792条肽段，其中包括一条lsdv的切割肽段，其序列如seq id no.3所示；

5、2)将1792条肽段的两端加上ecor i和hindⅲ的酶切位点以及同源臂序列后每条肽段的长度均为200bp，然后合成这些肽段；

6、3)以合成好的肽段序列为模板进行pcr扩增，将扩增产物胶回收后用ecorⅰ和hindⅲ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收备用；

7、4)使用t4连接酶将牛病毒的基因片段与t7噬菌体的基因组dna融合连接，将蛋白展示于t7噬菌体的衣壳表面，通过体外包装使其成为完整的噬菌体颗粒，并在宿主细胞上增殖，完成裂解性噬菌体展示文库的构建；

8、5)将感染lsdv的牛血清与噬菌体展示文库共孵育，用protein a和protein g包被的磁珠回收与抗体结合的噬菌体，利用噬菌体免疫共沉淀技术对噬菌体文库进行筛选；

9、6)以富集在磁珠上的噬菌体基因组为模板，设计引物，通过两轮扩增，对pcr产物进行高通量测序，利用开源软件对测序结果进行生物信息学分析，最终筛选出抗原蛋白并进行验证。

10、通过上述方法，本发明筛选到一种蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

11、为了对抗原蛋白进行验证，对筛选到的蛋白进行了表达纯化，步骤如下：

12、1)扩增表达该蛋白的核苷酸序列并克隆至蛋白表达载体pet28a，构建该蛋白的表达质粒；

13、2)将重组表达质粒转化至感受态细胞进行诱导表达，获得包含所述蛋白质的宿主菌；

14、3)利用his标签的蛋白纯化预装柱纯化蛋白从宿主菌中分离纯化所述蛋白质。

15、本发明的具体实施例中通过western blot和间接elisa试验验证了所述蛋白的反应原性。

16、本发明的具体实施例中还进一步验证了所述蛋白质检测lsdv的特异性和敏感性。

17、综合以上试验，本发明所筛选的蛋白质能够用于制备牛结节性皮肤病检测试剂盒。

18、本发明进一步提供了一种检测lsdv的间接elisa方法，包括以下步骤：

19、1)用所述的蛋白质包被酶标板；

20、2)用封闭液封闭酶标板；

21、3)将待测血清样品稀释后加入酶标板中进行一抗孵育；

22、4)将酶标二抗稀释后加入酶标板中进行酶标二抗孵育；

23、5)加入显色液和终止液，采用酶标仪测量od450数值并进行结果判定。

24、该方法可用于lsdv所致疾病的诊断，例如用于牛结节性皮肤病的诊断。另外，该方法也能用于以非疾病诊断为目的的lsdv实验室筛查鉴定。

25、当然，本发明的技术方案并不局限于实施例，利用本发明所提供的蛋白，本领域技术人员还能使用其它方法进行替换并用于检测，例如，利用该蛋白制备抗体并对lsdv抗原进行直接elisa检测，这些不经过创造性劳动的改进方案也都在本发明的保护范围内。

26、本发明的有益效果是：

27、本发明成功构建了一个牛病毒噬菌体展示文库，所提供的抗原蛋白是从噬菌体展示文库中筛选出来，是在病毒全基因组水平上进行的一种高通量、无偏见、低成本的筛选，其结果具有很高的准确性，同时也为其它牛病毒抗原蛋白的筛选作出了示范。

28、本发明筛选的抗原蛋白具有很高的反应原性，在lsdv诊断试剂研发中有很高的应用前景。

技术特征：

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.一种筛选权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：所述文库中一共有29株lsdv基因组序列和4522条蛋白序列，切割后一共有1792条肽段。

5.如权利要求3所述的筛选方法，其特征在于：在进行肽段切割时，首先将蛋白序列从n端开始切割成56氨基酸的肽段，然后在肽段的两端加上ecor i和hindⅲ的酶切位点以及同源臂序列，使每条肽段的长度均为200bp。

6.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，其特征在于包括以下步骤：

7.权利要求1所述的蛋白质在制备牛结节性皮肤病检测试剂盒中的应用。

8.一种试剂盒，该试剂盒中含有权利要求1所述的蛋白质。

9.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的基因或权利要求8所述的试剂盒在非诊断目的检测lsdv中的应用。

10.一种非诊断目的检测lsdv的方法，其特征在于包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了一种利用LSDV噬菌体展示文库高通量、无偏见筛选到的LSDV抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首先构建了展示LSDV的噬菌体文库，接着利用LSDV阳性血清对文库进行噬菌体免疫共沉淀筛选，通过二代测序以及数据分析，从文库中筛选出LSDV的抗原蛋白，经验证，该抗原蛋白能特异性与LSDV抗体反应，在LSDV诊断试剂研发中有很高的应用价值。

技术研发人员：陶攀,郭爱珍,董俊花,袁歆玮,张谦,赵慧
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24