一种WT1靶点肿瘤疫苗核酸序列、疫苗及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，尤其涉及到肿瘤疫苗设计，具体是涉及到一种经过优化的wt1靶点肿瘤疫苗。

背景技术：

1、核酸(dna或mrna)通过转录/翻译等步骤产生出蛋白。由于一种氨基酸对应多种不同的密码子，而组成一个蛋白的氨基酸数量非常巨大(通常几百或几千)，所以即使相同的蛋白氨基酸序列，对应的核酸序列也有无数种。而不同密码子组合的核酸序列产生的蛋白表达量差异非常大。在药物研发过程中，找到高蛋白表达的核酸序列，可以提高药物效果。

2、肿瘤疫苗是一种重要的抗肿瘤药物形式。很多肿瘤疫苗以核酸形式存在的，比如mrna疫苗，dna疫苗，病毒载体疫苗等。通过调整核酸序列，可以提高疫苗表达的抗原蛋白的表达量。

3、wt1(wilms’tumor gene 1)是一种肿瘤相关抗原，高表达于多种肿瘤，但在正常细胞低表达或不表达。wt1基因在白血病及各种实体瘤包括：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、间皮瘤中高表达，在这些肿瘤中起特异性癌基因作用，因此wt1肽是一个新的超表达的肿瘤特异性抗原。据悉，由国外的大阪大学开发的“wt1肽”已在75种病症抗原中的9个项目中进行了评估，被国外权威专业学会杂志《clin cancer res》评为最优秀的专利技术，排名第一的最佳病症抗原。日本东京大学医科学研究所结合“wt1肽抗原”研发新一代树突细胞疫苗技术，与许多熟知的树突状细胞疗法完全不同。特别根据患者的“hla(人类白细胞抗原)”类型的检测结果，将最适合患者的wt1肽掺入从患者血液培养的树突状细胞中，制备与患者的hla相容，最有效的疫苗。

4、根据以往的研究表明，wt1疫苗接种可以诱导wt1特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，并导致癌症消退，而不会对临床环境中的正常组织造成损害。通过调整wt1肿瘤疫苗的核酸序列，检测蛋白表达量可用于筛选出适合进一步制备成疫苗的优选核酸序列，提高wt1疫苗的表达量，进而增强疫苗抗肿瘤效果。

技术实现思路

1、基于此，本发明的目的是以wt1为靶点的肿瘤疫苗进行序列优化，并通过实验在候选序列中筛选到了最佳序列。该最佳wt1靶点的mrna疫苗序列为蛋白表达量最高的mrna疫苗核酸序列，其具有激活树突状细胞作用和良好抗肿瘤效果。

2、为实现发明目的采用的技术方案如下。

3、本发明的第一目的是提供一种wt1疫苗的核酸序列，其dna序列如seq id no.2所示。

4、一种wt1疫苗的核酸序列，其mrna序列如seq id no.12所示。

5、在其中一些实施例中，将上述wt1 mrna疫苗的核酸序列优化得到10条优化核酸序列(dna序列如seq id no.1-10所示的)，将所述优化序列和野生型的wt1序列通过体外转录制备成mrna，转染ct26细胞后，通过western blot的方法测定目标蛋白表达量，经多方筛选，得到蛋白表达量最高的wt1 mrna疫苗的核酸序列，所述wt1 mrna疫苗的核酸序列如seqid no.2所示，其mrna序列如seq id no.12所示。

6、本发明的第二目的是提供含有上述wt1疫苗的核酸序列的wt1疫苗的制备方法，包括以下步骤：

7、1)酶切含有如seq id no.2所示的dna序列的质粒，获得线性化模板，纯化；

8、2)将纯化后的线性化模板进行体外转录，37℃孵育1.8h-2.2h，纯化，获得纯化后的rna；

9、3)将步骤2)获得的纯化后的rna加帽并纯化，获得加帽的mrna。

10、本发明的第三目的是提供上述制备方法制备得到的wt1疫苗，是由上述mrna序列和包封所述mrna的载体材料制备而成的颗粒组成，所述载体材料选自鱼精蛋白、脂质纳米颗粒、高分子材料和无机纳米颗粒。

11、在其中一些实施例中，所述载体材料可以选自鱼精蛋白、脂质纳米颗粒(lnp)、高分子材料和无机纳米颗粒。

12、在其中一些实施例中，所述载体材料是脂质纳米颗粒。在其中一些实施例中，所述脂质纳米颗粒可以包含离子化脂质、聚乙二醇化脂质、胆固醇及衍生物和中性辅助磷脂中的一种或多种。例如，脂质纳米颗粒可以包含阳离子磷脂(ionizable lipids)，中性辅助磷脂，胆固醇，聚乙二醇修饰的磷脂(pegylated lipid)的任一种，其中任意两种、任意三种或全部四种的组合。

13、在其中一些实施例中，所述脂质纳米颗粒包括sm102或mc3。

14、在其中一些优选的实施例中，所述脂质纳米颗粒为sm102。

15、在其中一些优选的实施例中，所述脂质纳米颗粒的材料为质量比：50±2：10±1：38.5±1：1.5±0.1的sm102：dspc：胆固醇：dmg-peg2000；

16、当wt1-017 mrna浓度为100ng/μl时，使用无水乙醇为溶剂配制乙醇相中sm102浓度为5.62mg/ml，总脂质体浓度为10.28mg/ml，水相和乙醇相的用量比为3:1。

17、本发明的第四目的是提供上述wt1疫苗的核酸序列或wt1靶点疫苗的制备方法获得的mrna在制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗中的应用。在其中一些实施例中，所述肿瘤是瘤内高度表达wt1蛋白的肿瘤。

18、在其中一些实施例中，所述肿瘤是乳腺癌、间皮瘤、肺癌、骨髓纤维化的骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病。

19、本发明的第五目的是提供上述wt1疫苗在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

20、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

21、本发明针对以wt1为靶点的肿瘤疫苗进行密码子优化，从优化的10条序列中筛选出蛋白表达量最高的序列wt1-017作为靶点的最优序列。通过实验证明利用该wt1-017疫苗序列制备的核酸疫苗有激活树突状细胞作用和良好抗肿瘤效果。

技术特征：

1.一种wt1靶点疫苗的核酸序列，其中，所述wt1疫苗核酸序列的dna序列如seq idno.2所示。

2.一种wt1靶点疫苗的核酸序列，其中，所述wt1疫苗核酸序列的mrna序列如seq idno.12所示。

3.一种wt1靶点疫苗的核酸序列的制备方法，其中，所述制备方法包括以下步骤：

4.权利要求1或2所述的核酸序列或权利要求3所述制备方法获得的mrna在制备预防和/或治疗肿瘤的疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述肿瘤是瘤内高度表达wt1蛋白的肿瘤。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述肿瘤是乳腺癌、间皮瘤、肺癌、骨髓纤维化的骨髓增生异常综合征、急性髓系白血病。

7.一种wt1疫苗，其中，所述wt1疫苗由包括权利要求1或2所述的核酸序列或权利要求3所述制备方法得到的mrna，以及药学上可接受的载体制备而成。

8.根据权利要求7所述的wt1疫苗，其中，所述wt1疫苗由权利要求2中所述的mrna序列和包封所述mrna的载体材料制备而成的颗粒，所述载体材料选自鱼精蛋白、脂质纳米颗粒、高分子材料和无机纳米颗粒。

9.根据权利要求8所述的wt1疫苗，其中，所述载体材料是脂质纳米颗粒。

10.权利要求所7-9任一项所述wt1疫苗在制备防治肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤为瘤内高度表达wt1蛋白的肿瘤。

技术总结
本发明公开了一种WT1靶点肿瘤疫苗的核酸序列、疫苗及其应用，本发明技术人员在研究过程中找到10条潜在高表达的WT1疫苗候选核酸序列，从中筛选得到表达量最高的WT1疫苗核酸序列作为WT1靶点肿瘤疫苗核酸序列，进而验证由其制得的mRNA疫苗具有较强的抑制肿瘤效果且该序列作为肿瘤抗原具有激活树突状细胞的功能，为研究制备防治肿瘤的药物方向上的应用提供可能。

技术研发人员：潘有东,马璐,车令君,张梦雅,卫静,朱蕾,王弈,万季,赵钊
受保护的技术使用者：北京新合睿恩生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17