抗人Caldesmon蛋白单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用的制作方法

本技术涉及免疫球蛋白，具体涉及抗人caldesmon蛋白单克隆抗体及其杂交瘤细胞株和应用。

背景技术：

1、钙调蛋白结合蛋白（caldesmon，cad）是一种肌动蛋白结合蛋白，是细胞运动的重要调节因子，与许多细胞运动有关，如细胞内的运输、细胞形态的维持、细胞的粘附和迁移以及平滑肌收缩等。

2、cad最初从鸡胗中分离得来，人类cald1基因编码caldesmon蛋白，由14个外显子组成，位于7q33-q34区域。单个基因通过外显子和不同启动子的选择性剪接编码出两种不同的分子量亚型：高分子量异构体cad（h-caldesmon，h-cad）和低分子量异构体cad（l-caldesmon，l-cad）。h-cad在内脏和血管的平滑肌细胞以及肌上皮细胞中表达，主要通过与肌动蛋白和原肌球蛋白结合来调节肌肉收缩；l-cad仅在非肌肉细胞中表达。cad的肌动蛋白结合域主要位于分子的羧基端，而肌球蛋白结合域位于分子的氨基端，h-cad和l-cad异构体具有相似的序列和生化特性。本文专利仅涉及高分子量钙调蛋白结合蛋白h-cad，因此后续所提caldesmon均指h-cad。

3、子宫富于细胞型平滑肌瘤（cellular leiomyoma，cl）和子宫内膜间质肉瘤（endometrial stromal sarcoma，ess）在形态学上存在着交叉，ess可伴有平滑肌分化，尤其是低度恶性子宫内膜间质肉瘤，致使两者仅凭形态学检查很难作出准确的诊断。目前临床上主要通过免疫组织化学（简称免疫组化，immunohistochemistry，ihc）病理实验检测肿瘤组织中的蛋白的表达状况，研究发现caldesmon不仅仅是平滑肌的特异性标志物，且在ess上不表达，认为caldesmon是鉴别诊断cl和ess的一个敏感及特异性指标物。cl属于特殊类型平滑肌瘤，为良性肿瘤，但ess容易局部复发和远处转移，因此明确鉴别两者具有重要的临床价值。

4、为此，研制出一种特异性高的针对caldesmon蛋白的单克隆抗体具有深远意义。

技术实现思路

1、有鉴于此，本技术提供了一种抗人caldesmon蛋白的单克隆抗体、能够分泌所述抗人caldesmon蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及该抗人caldesmon蛋白单克隆抗体和杂交瘤细胞株的应用。

2、第一方面，本技术提供了一种抗人钙调蛋白结合蛋白（caldesmon）的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含vl结构域，所述vl结构域包含seq id no.4所示氨基酸序列的cdr-l1，seq id no.5所示氨基酸序列的cdr-l2和seq id no.6所示氨基酸序列的cdr-l3。

3、进一步地，所述单克隆抗体还包含vh结构域，所述vh结构域包含seq id no.8所示氨基酸序列的cdr-h1，seq id no.9所示氨基酸序列的cdr-h2和seq id no.10所示氨基酸序列的cdr-h3。

4、采用上述技术方案，本技术提供的抗caldesmon蛋白单克隆抗体能够与caldesmon蛋白特异性结合，显著提高了其免疫检测的特异性、准确性和可靠性。

5、进一步地，所述vl结构域包含如seq id no.3所示的氨基酸序列，或包含seq idno.3所示的氨基酸序列中任一个或多个氨基酸经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰得到的具有90％以上同源性的氨基酸序列，优选地，具有90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的氨基酸序列。

6、进一步地，所述vl结构域全长为109个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为26、17、36和11，cdr-l1-3结构域氨基酸数分别为11、3和5，分别为27aa-37aa，55aa-57aa和94aa-98aa，其氨基酸序列分别：qslvhsngytn（seq id no.4）、ivs（seq id no.5）、sqsth（seq id no.6）。

7、进一步地，所述vh结构域包含如seq id no.7所示的氨基酸序列，或包含seq idno.7所示的氨基酸序列中任一个或多个氨基酸经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰得到的具有90％以上同源性的氨基酸序列，优选地，具有90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同源性的氨基酸序列。

8、进一步地，所述vh结构域全长为114个氨基酸，其fr的4个结构域氨基酸数分别为25、17、38和11，cdr-h1-3结构域氨基酸数分别为10、7和6，分别为26aa-35aa，53aa-59aa和98aa-103aa，其氨基酸序列分别为：gfslstsgmg（seq id no.8）、iwwdddv（seq id no.9）、arrpkg（seq id no.10）。

9、进一步地，所述单克隆抗体由杂交瘤细胞株oti3e8分泌产生，所述杂交瘤细胞株oti3e8的保藏编号为cgmcc no.45716，2023年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理管理委员会普通微生物中心（cgmcc）。

10、第二方面，本技术提供了一种能够分泌抗人钙调蛋白结合蛋白（caldesmon）的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为oti3e8，其保藏编号为cgmcc no.45716，2023年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理管理委员会普通微生物中心（cgmcc）。

11、采用上述技术方案，本技术的杂交瘤细胞株oti3e8可以稳定分泌抗人钙调蛋白结合蛋白（caldesmon）单克隆抗体。

12、第三方面，本技术还提供了第一方面所述的单克隆抗体在制备标记组织中人钙调蛋白结合蛋白（caldesmon）的免疫组化检测试剂盒中的应用。

13、进一地，所述组织包含子宫平滑肌瘤、阑尾、肾脏和前列腺癌等组织。

14、第四方面，本技术还提供了一种人钙调蛋白结合蛋白（caldesmon）的免疫组化检测试剂盒，所述免疫组化检测试剂盒包括一抗试剂，所述一抗试剂含有第一方面所述的单克隆抗体。

15、进一地，所述试剂盒还包括抗原修复液、内源性过氧化物酶阻断剂、超敏二抗试剂、dab底物缓冲液、dab浓缩显色液、苏木素染色液。

16、采用上述技术方案，试剂盒中含有本技术提供的抗人caldesmon蛋白的单克隆抗体，可以建立了免疫组化检测方法，实现在子宫平滑肌瘤、阑尾、肾脏以及前列腺癌等组织中对人caldesmon蛋白的特异性标记。

17、保藏信息

18、用于保藏的杂交瘤细胞株：鼠抗人caldesmon单克隆杂交瘤细胞株oti3e8；

19、保藏编号：cgmcc no.45716；

20、保藏日期：2023年9月6日；

21、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；

22、保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

23、相对于现有技术而言，本技术提供了能够特异性结合人caldesmon蛋白的单克隆抗体，其中包括通过杂交瘤技术筛选获得针对人caldesmon蛋白的单克隆抗体。同时，本技术还基于该抗人caldesmon蛋白单克隆抗体建立了免疫组化检测方法及检测试剂盒，采用本技术的免疫组化检测试剂盒可以在子宫平滑肌瘤、阑尾、肾脏以及前列腺癌等组织中对人caldesmon蛋白实现特异性标记，该单克隆抗体可以用于免疫组织的化学检测以及用于鉴别与人caldesmon蛋白表达相关的肿瘤。