一种靶向白蜡窄吉丁Prosβ6基因的dsRNA及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物，特别是涉及一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna及其制备方法和应用。

背景技术：

1、白蜡窄吉丁(emerald ash borer，eab，agrilus planipennis fairmaire)，又名梣小吉丁、花曲柳窄吉丁，属鞘翅目(coleoptera)吉丁甲科(buprestidae)窄吉丁属(agrilus)，危害木犀科(oleaceae)白蜡属(fraxinus)树木。主要危害引进的北美白蜡树种，如美国红梣(洋白蜡，fraxinus pennsylvanica marsh.)、毡毛梣(绒毛白蜡，f.velutina torr)与美国白蜡(f.americana linn.)等，已成为重要的国际检疫性蛀干害虫之一。因此，白蜡窄吉丁的防治受到了林业昆虫学家的关注。

2、白蜡窄吉丁是蛀干类害虫，幼虫取食隐蔽性强，很难用常规的杀虫剂触碰并杀灭，防治起来比较困难。目前针对白蜡窄吉丁的有效的防治方法也十分有限。rna干扰作为一种具有应用前景的新型害虫防治技术，在白蜡窄吉丁防控中具有较好的潜力。蛋白酶β亚基是蛋白酶体中的一个重要组成部分，它在蛋白质降解中发挥着关键的作用。蛋白酶体亚单位β参与了调控蛋白质的降解过程,同时也参与了细胞的信号传导和调节机制，可促进蛋白质的降解速率，保证细胞的正常代谢和运作。prosβ6基因沉默可导致昆虫停止进食，同时代谢物积累并致死，是害虫rnai的良好靶标。但目前没有能有效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna及其制备方法和应用。本发明提供的dsrna能高效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因，注射后第3天的相对表达量降低了89.69％，随着时间的增加，dsrna沉默效果持续存在。

2、为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、本发明提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明提供了一种制备上述技术方案所述dsrna的引物组，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；

5、所述第一引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述第一引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.3所示；

6、所述第二引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述第二引物对的下游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示。

7、本发明提供了上述技术方案所述dsrna的制备方法，包括以下步骤：

8、以白蜡窄吉丁的cdna为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第一引物对进行第一pcr扩增，得到第一合成模板；

9、以白蜡窄吉丁的cdna为模板，利用上述技术方案所述引物组中的第二引物对进行第二pcr扩增，得到第二合成模板；

10、利用所述第一合成模板和第二合成模板进行dsrna合成，得到所述第一rna分子和第二rna分子；

11、将所述第一rna分子和第二rna分子复性，得到所述dsrna。

12、优选的，所述第一pcr扩增和第二pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

13、本发明提供了上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna在防治白蜡窄吉丁中的应用。

14、本发明提供了上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna在制备防治白蜡窄吉丁的制剂中的应用。

15、本发明提供了一种防治白蜡窄吉丁的制剂，所述制剂包括上述技术方案所述的dsrna或利用上述技术方案所述的引物组制备得到的dsrna或利用上述技术方案所述制备方法制备得到的dsrna。

16、优选的，所述dsrna的有效剂量≥3μg/只。

17、有益效果：

18、本发明提供了一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。本发明提供的dsrna能高效沉默白蜡窄吉丁prosβ6基因，注射后第3天的相对表达量降低了89.69％，随着时间的增加，dsrna沉默效果持续存在，能够导致白蜡窄吉丁生长发育受到限制，影响成虫进一步活动和繁育，最终达到防治的效果，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。

技术特征：

1.一种靶向白蜡窄吉丁prosβ6基因的dsrna，其特征在于，所述dsrna由第一rna分子和第二rna分子组成；所述第一rna分子和第二rna分子互补配对；所述第一rna分子的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种制备权利要求1所述dsrna的引物组，其特征在于，所述引物组包括第一引物对和第二引物对；

3.权利要求1所述dsrna的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述第一pcr扩增和第二pcr扩增的反应程序均包括：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

5.权利要求1所述的dsrna或利用权利要求2所述的引物组制备得到的dsrna或利用权利要求3或4所述制备方法制备得到的dsrna在防治白蜡窄吉丁中的应用。

6.权利要求1所述的dsrna或利用权利要求2所述的引物组制备得到的dsrna或利用权利要求3或4所述制备方法制备得到的dsrna在制备防治白蜡窄吉丁的制剂中的应用。

7.一种防治白蜡窄吉丁的制剂，其特征在于，所述制剂包括权利要求1所述的dsrna或利用权利要求2所述的引物组制备得到的dsrna或利用权利要求3或4所述制备方法制备得到的dsrna。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述dsrna的有效剂量≥3μg/只。

技术总结
本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种靶向白蜡窄吉丁Pros β6基因的dsRNA及其制备方法和应用。本发明提供的dsRNA能高效沉默白蜡窄吉丁Pros β6基因，注射后第3天Pros β6基因的相对表达量降低了89.69％，随着时间的增加，dsRNA沉默效果持续存在，能够导致白蜡窄吉丁生长发育受到限制，影响成虫进一步活动和繁育，最终达到防治的效果，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。

技术研发人员：张苏芳,樊智智,张荣,陈静,孔祥波,张真,刘福,方加兴
受保护的技术使用者：中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所（国家林业和草原局世界自然遗产保护研究中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/3/5