一种用于生产肌苷的基因工程菌及其构建方法与应用与流程

本发明属于生物，尤其涉及是一种用于生产肌苷的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、肌苷是一种嘌呤核苷，参与机体物质代谢和能量代谢，具有重要的应用价值。在医药领域，肌苷常用于肝病、心脏病等疾病治疗药物的生产，也用于异丙肌苷和利巴韦林等抗病毒药物的合成。在食品领域，肌苷是复合鲜味剂“i+g”的重要原料。此外，肌苷还被广泛应用在农业、化工和营养保健等诸多领域。

2、目前，肌苷生产方式主要为微生物发酵法，该方法可以利用廉价碳源葡萄糖为底物从头合成肌苷。但目前微生物发酵法生产肌苷所采用的生产菌株大多数以腺嘌呤作为缺陷物质进行添加，造成生产成本上升、发酵工艺复杂、生产稳定性降低，并且腺嘌呤作为最基础的嘌呤碱基，0.1g/l的添加量就会对微生物的生长产生抑制作用，其添加方式及添加量对肌苷工业化的生产都会造成一定的困难。

3、为了降低生产成本和工业生产的难度，开发一株非腺嘌呤缺陷型、生产成本较低的肌苷生产菌株成为目前亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于生产肌苷的基因工程菌及其构建方法与应用。该基因工程菌不含质粒、从头合成肌苷，具有遗传背景清晰、生产成本较低、无腺嘌呤缺陷等优点。

2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种用于生产肌苷的基因工程菌，所述基因工程菌命名为e.coli-sise，所述e.coli-sise通过基因改造获得的；所述改造的具体方法如下：首先通过在e.colimg1655-1的基因组yjiv位点引入异源的嘌呤操纵子pur基因，由ptrc启动子启动；然后通过敲除肌苷的分解途径嘌呤核苷磷酸化酶的ppnp基因、xapa基因、pgef基因、deod基因，阻断肌苷的分解，以及敲除imp脱氢酶的guab基因，阻断imp的分流；其次敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因，并在基因组yghe和ilvg位点分别引入prpp转酰胺酶的抗反馈变体purfbsud293v,k316q,s400w和prpp合成酶的抗反馈变体prsecod128a，均由ptrc启动子启动；最后通过在基因组yeep位点引入内源的腺苷脱氨酶add基因，并由ptrc启动子启动。

4、优选的，所述e.coli mg1655-1是通过整合过噬菌体t7rna聚合酶的大肠杆菌e.coli mg1655获得的。

5、优选的，所述嘌呤操纵子pur基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述嘌呤操纵子pur基因来源于b.subtilis 168。

6、优选的，所述嘌呤核苷磷酸化酶ppnp基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述嘌呤核苷磷酸化酶xapa基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述嘌呤核苷磷酸化酶pgef基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述嘌呤核苷磷酸化酶deod基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述imp脱氢酶guab基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因的核苷酸序列如seq id no.7所示。

7、优选的，所述prpp转酰胺酶的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述prpp转酰胺酶抗反馈变体purfbsud293v,k316q,s400w的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述prpp合成酶的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述prpp合成酶抗反馈变体prsecod128a的核苷酸序列如seq idno.11所示；所述腺苷脱氨酶add基因的核苷酸序列如seq id no.12所示。

8、优选的，一种上述用于生产肌苷的基因工程菌的构建方法，包括以下具体步骤：

9、(1)通过在e.coli mg1655-1的基因组yjiv位点引入异源的嘌呤操纵子pur基因，由ptrc启动子启动，增强嘌呤核苷代谢途径的碳代谢流；

10、(2)先敲除肌苷的分解途径嘌呤核苷磷酸化酶ppnp基因、xapa基因、pgef基因、deod基因，阻断肌苷的分解途径，然后再敲除imp脱氢酶的guab基因，加强肌苷合成途径的碳代谢流；

11、(3)敲除嘌呤核苷酸阻遏蛋白基因，并在基因组yghe位点引入枯草芽孢杆菌的prpp转酰胺酶的抗反馈变体purfbsud293v,k316q,s400w，由ptrc启动子启动转录，在基因组ilvg位点引入内源的prpp合成酶抗反馈变体prsecod128a，由ptrc启动子启动，初步解除嘌呤合成途径的反馈阻遏及抑制；

12、(4)通过在基因组yeep位点引入内源的腺苷脱氨酶add基因，并由ptrc启动子启动，实现腺苷方向碳代谢流的回收。

13、优选的，上述基因工程菌在发酵生产肌苷中的应用。

14、优选的，所述应用包括采用摇瓶或发酵罐发酵培养所述基因工程菌，并从其培养物中收集得到肌苷。

15、优选的，所述摇瓶发酵培养的方法为：将所述基因工程菌划线接种至活化斜面进行活化培养，用接种环刮取活化斜面培养后的菌种种子接种至装有种子培养基的三角瓶中，纱布封口，将所述装有种子培养基的三角瓶移至恒温震荡培养箱培养10h，恒温震荡培养箱的温度维持在36℃，振荡转速为200r/min，得所述基因工程菌的菌种活化后制备的种子液；按10％-15％接种量接种所述基因工程菌的菌种活化后制备的种子液到装有发酵培养基的三角瓶中，纱布封口，将所述装有发酵培养基的三角瓶移至恒温震荡培养箱中，温度维持在36.8-37.2℃，以220r/min的转速振荡培养，发酵培养过程中通过补加质量分数25％的氨水来维持ph在7.0-7.2，通过添加质量分数60％的葡萄糖溶液补充菌体所需的碳源，发酵周期为30-45h，得肌苷；

16、所述发酵罐培养的方法为：

17、步骤s1、菌种活化：将所述基因工程菌菌种从甘油管接种至斜面培养基活化培养11-13h，将活化培养后的菌种从斜面培养基中接种至茄形瓶培养基中继续活化扩大培养10-12h，培养温度均为37℃；

18、步骤s2、种子培养：将无菌水于超净台火焰附近倒入上述茄形瓶中，使用接种环将步骤s1中活化扩大培养后的菌种菌落刮至无菌水中并打散制备成菌悬液，在发酵罐火圈旁将所述菌悬液接种至发酵种子培养罐中，进行菌种扩大培养；培养过程ph维持在6.7-7.0，温度维持在37℃，溶氧维持在35％-50％，培养至od为20时转接种至发酵罐中进行发酵培养；

19、步骤s3、发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，发酵周期为30-45h，得肌苷；所述发酵罐发酵培养的ph维持在6.4-6.7，温度维持在37℃，溶氧维持在30％-50％；发酵培养过程中通过流加质量分数80％的葡萄糖溶液维持发酵过程菌体所需的碳源，通过添加质量分数25％的氨水来调节ph。

20、优选的，所述种子培养基为：葡萄糖30g/l、酵母浸粉6g/l、蛋白胨4g/l、(nh4)2so43g/l、，mgso4·7h2o 0.5g/l、，kh2po42g/l、feso4·7h2o 10mg/l、vb(1、3、5、12)各0.5mg/l、鸟嘌呤100mg/l和vh 1mg/l；所述发酵培养基为：葡萄糖30g/l、酵母浸粉6g/l、蛋白胨2g/l、柠檬酸2g/l、(nh4)2so43g/l、mgso4·7h2o 1g/l、kh2po43g/l、feso4·7h2o 20mg/l、vb(1.3.5.12)各2mg/l、vh 1mg/l和鸟嘌呤200mg/l。

21、上述培养基均可采用标准方法制备获得。

22、与现有技术相比，本发明具备的积极有益效果在于：

23、该本发明通过以e.colimg1655-1为底盘微生物，首先引入异源的嘌呤核苷操纵子基因，敲除肌苷的分解途径，敲除关键分支途径，解除嘌呤合成途径的关键反馈抑制，最后通过双拷贝内源的腺苷脱氨酶基因实现amp方向的碳流回收，构建出一株不含质粒、从头合成肌苷的基因工程菌e.coli-sise，该基因工程菌e.coli-sise具有遗传背景清晰、生产成本较低、无腺嘌呤缺陷等优点；与现有的肌苷生产工艺相比，该基因工程菌e.coli-sise菌株发酵生产肌苷具有生产成本较低、发酵过程中无需添加腺嘌呤、相对成本较低等优点，具有很好的工业应用前景。