毛乳头细胞体外分离的纯化方法

本发明属于生物细胞，具体涉及一种毛乳头细胞体外分离的纯化方法。

背景技术：

1、脱发是临床常见疾病，虽不危及生命，但严重影响患者身心健康及生活质量，给患者及社会造成巨大的经济负担。而毛乳头细胞（dermal papilla cells, dpcs）是毛囊形态学发生的关键，被认为是促进毛发再生的重要种子细胞来源之一[1]。小鼠是毛发疾病及再生研究的重要模型和工具[2]，但传统的小鼠dpcs分离培养方法效率低、来源有限且极易老化，严重限制了毛囊再生及毛发相关疾病研究的发展[3]。因此，迫切需要建立更快速、高效的新方法。

2、[1]hwang d, lee h, lee j, et al. micro-current stimulation haspotential effects of hair growth-promotion on human hair follicle-derivedpapilla cells and animal model[j]. int j mol sci, 2021, 22 (9)..

3、[2]hu s, li z, lutz h, et al. dermal exosomes containing mir-218-5ppromote hair regeneration by regulating beta-catenin signaling[j]. sci adv,2020, 6 (30): eaba1685.

4、[3]stenn k s, paus r. controls of hair follicle cycling[j]. physiolrev, 2001, 81 (1): 449-494.

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种毛乳头细胞体外分离的纯化方法。

2、为达到上述目的，本发明的解决方案是：

3、一种毛乳头细胞体外分离的纯化方法，该纯化方法包括：将离体小鼠的毛囊置于dmem培养基中进行消化，并加入等体积全培养基终止消化，离心，弃上清液，收集组织块并用碱性成纤维细胞生长因子吹打混匀，种植于培养板上，在细胞培养箱中培养。

4、进一步地，dmem培养基含0.1% 胶原酶nb4。

5、进一步地，全培养基由血清、青-链霉素溶液、dmem培养基配制。

6、进一步地，消化的温度为37℃，时间为30-45min。

7、进一步地，离心的转速为1500-2000r/min，时间为8-10min。

8、进一步地，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml。

9、进一步地，细胞培养箱中含5%的co2，温度为37℃。

10、由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

11、第一、本发明的培养基中添加10ng/ml的bfgf，显著缩短了dpcs的迁移和生长融合时间，提高了纯化效率，也有利于维持dpcs的生物学功能。

12、第二、本发明在传统方法的基础上，结合精细解剖、酶消化及细胞培养体系优化，建立了分离培养小鼠dpcs的改良新方法，以显微弯剪充分剪碎毛乳头组织后用胶原酶消化，组织分解更充分，不但提高了贴壁率，而且接种密度实际上远高于传统方法，可获取更多数量、更好功能的dpcs，是一种更快速、高效的dpcs分离培养方法，为将来毛囊发育、再生及毛发相关疾病研究提供可靠的保障。

技术特征：

1.一种毛乳头细胞体外分离的纯化方法，其特征在于：该纯化方法包括：将离体小鼠的毛囊置于dmem培养基中进行消化，并加入等体积全培养基终止消化，离心，弃上清液，收集组织块并用碱性成纤维细胞生长因子吹打混匀，种植于培养板上，在细胞培养箱中培养。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述dmem培养基含0.1% 胶原酶nb4。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述全培养基由血清、青-链霉素溶液、dmem培养基配制。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述消化的温度为37℃，时间为30-45min。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述离心的转速为1500-2000r/min，时间为8-10min。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：所述细胞培养箱中含5%的二氧化碳，温度为37℃。

技术总结
本发明提供了一种毛乳头细胞体外分离的纯化方法，该方法包括：获取离体小鼠的毛乳头部位，联合胶原酶消化，并添加碱性成纤维细胞生长因子以优化培养体系，建立体外分离的纯化方法；以光镜下观察、细胞计数、碱性磷酸酶特异性染色及荧光定量PCR鉴定DPCs的ALP mRNA表达水平；与传统方法比较，本发明的毛乳头基本全部贴壁，并可更快迁出及生长融合，所获得的细胞数量是传统方法的5.85倍；且改良方法的毛乳头细胞具有更强的ALP活性，尤其是第5代细胞更为明显；改良方法可获取更多数量、并具有较好功能的小鼠毛乳头细胞，为开展毛囊相关研究提供可靠的细胞来源。

技术研发人员：何晶,林享玉,祝佳铭,沈辰云,朱亮,陈建军
受保护的技术使用者：同济大学
技术研发日：
技术公布日：2024/5/6