一种通用数字PCR检测体系及其应用的制作方法

本发明属于核酸检测及生物医药，具体涉及一种通用数字pcr检测体系及其应用。

背景技术：

1、核酸扩增是临床诊断领域不可缺少的检测工具，包括对基因型的区分和患者标本中病原体的准确定量。基于聚合酶链反应(pcr)的技术为微量初始目标序列的扩增提供了强有力的工具。该方法已经从基于凝胶分析的低通量的普通pcr，发展到基于荧光技术的实时定量pcr，以及使用数千个微反应器的数字pcr(ddpcr)，且数字pcr具有绝对定量的优势，是第三代pcr检测技术。

2、现有的扩增技术通常采用非选择性的dna染料或目标特异性荧光探针。dna染料适合于低成本的核酸检测和定量，但在多重性和非特异性扩增方面受到限制。相比之下，荧光标记的靶向特异性寡核苷酸(如水解探针或分子信标)基于荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移(fret)，并与目标序列直接相互作用。将目标特异性探针序列标记上不同的荧光基团，就能够在反应中高特异性地检测多个目标。但是荧光基团标记会增加分析成本，而且成本的增加与检测目标数量的增加成正比。可见，现有的扩增技术多存在效率低或成本高的弊端。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种通用数字pcr检测体系及其应用，所述通用数字pcr检测体系可以实现高效、通用且低成本的核酸定性定量检测。

2、本发明提供了一种通用数字pcr检测体系，包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和pcr扩增试剂；

3、所述特异性介导探针由互补序列和突出序列组成；所述互补序列位于所述特异性介导探针的3’端，且与靶标模板互补；

4、所述突出序列位于所述特异性介导探针的5’端，且与靶标模板不互补；

5、所述特异性介导探针的3’末端连接有阻止序列延伸的基团；

6、所述辅助靶标序列由3’端序列、间隔序列和5’端序列组成；所述5’端序列与通用探针互补；所述间隔序列包括n个随机碱基，所述n为大于等于1的整数；所述3’端序列与介导引物互补，所述介导引物为所述特异性介导探针在扩增过程中被dna聚合酶酶解形成，所述介导引物由所述特异性介导探针的突出序列和1～2个互补序列上的靶标特异性碱基组成；

7、所述辅助靶标序列的3’末端连接m个连续碱基，5’末端连接k个连续碱基，所述m和k分别为大于等于2的整数。

8、优选的，所述互补序列的长度为15～35个碱基；所述突出序列的长度为5～25个碱基；所述阻止序列延伸的基团包括磷酸修饰基团、mgb修饰基团或与靶标模板不互补的短序列；所述与靶标模板不互补的短序列的长度为2个以上碱基。

9、优选的，所述5’端序列的长度为15～30个碱基；所述3’端序列的长度为5～25个碱基；所述间隔序列的长度为1个以上碱基。

10、优选的，所述介导引物中的1～2个靶标特异性碱基位于所述介导引物的3’端；所述介导引物不与任何已知物种的核苷酸序列互补。

11、优选的，所述通用探针的长度为15～30个碱基，所述通用探针的5’端修饰有发光基团，所述通用探针的3’端和/或中间位置分别修饰有猝灭基团。

12、优选的，所述靶标引物的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.7、seq id no.13、seq id no.20或seq id no.25所示；

13、所述靶标引物的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.8、seq idno.14、seq id no.21或seq id no.26所示；

14、所述通用探针的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.10所示；

15、所述特异性介导探针的核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.11、seq idno.16、seq id no.18、seq id no.23或seq id no.28所示；

16、所述辅助靶标序列的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.12、seq id no.17、seq id no.19、seq id no.24或seq id no.29所示。

17、优选的，所述通用数字pcr检测体系的核苷酸序列如组合1)～组合6)中的一种或多种所示：

18、所述组合1)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5和seq idno.6所示；

19、所述组合2)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11和seq idno.12所示；

20、所述组合3)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.13、seq id no.14、seq id no.10、seq id no.16和seq idno.17所示；

21、所述组合4)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.10、seq id no.18和seq idno.19所示；

22、所述组合5)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.20、seq id no.21、seq id no.10、seq id no.23和seq idno.24所示；

23、所述组合6)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.25、seq id no.26、seq id no.10、seq id no.28和seq idno.29所示。

24、优选的，所述通用数字pcr检测体系中靶标引物的浓度为0.3～3μm，特异性介导探针的浓度为0.3～3μm，通用探针的浓度为0.3～3μm、辅助靶标序列的浓度为0.3～3μm。

25、本发明还提供了上述技术方案所述的通用数字pcr检测体系在基因的检测和/或定量中的应用。

26、优选的，所述基因的检测和/或定量的模板包括基因组dna、cdna、质粒dna或单链dna。

27、有益效果：

28、本发明提供了一种通用数字pcr检测体系，包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和pcr扩增试剂；所述特异性介导探针由互补序列和突出序列组成；所述互补序列位于所述特异性介导探针的3’端，且与靶标模板互补；所述突出序列位于所述特异性介导探针的5’端，且与靶标模板不互补；所述特异性介导探针的3’末端连接有阻止序列延伸的基团；所述辅助靶标序列由3’端序列、间隔序列和5’端序列组成；所述5’端序列与通用探针互补；所述间隔序列包括n个随机碱基，所述n为大于等于1的整数；所述3’端序列与介导引物互补，所述介导引物为所述特异性介导探针在扩增过程中被dna聚合酶酶解形成，所述介导引物由所述特异性介导探针的突出序列和1～2个互补序列上的靶标特异性碱基组成；所述辅助靶标序列的3’末端连接m个连续碱基，5’末端连接k个连续碱基，所述m和k分别为大于等于2的整数。

29、本发明所述通用数字pcr检测体系在进行pcr检测时的原理图如图1所示，具体原理如下：特异性介导探针结合靶标序列，在dna聚合酶(taq酶)延伸中被酶切，生成带有1～2个特异性碱基的介导引物，这些不断累积的介导引物能够结合辅助靶标序列，并延伸酶切结合在辅助靶标上的通用探针，实现荧光信号的释放。这里通用探针因为猝灭基团距离荧光基团较近，因此能够产生较低的荧光背景，原因在于数字pcr检测荧光时，辅助靶标和探针处于杂交状态，因为杂交原因，修饰在探针两端的猝灭基团和荧光基团的距离会增加，导致背景升高，以至于淹没靶标检测增加的荧光。同时，本发明所述通用数字pcr检测体系可以实现同一通用探针的多靶标定量检测成本更低，效果更高。