突变的Taq酶和其编码多核苷酸的制作方法

本发明属于生物，具体地说，本发明涉及一种具有高扩增活性的耐热dna聚合酶突变体。

背景技术：

1、taq酶是一种来源于耐热性细菌thermus aquaticus的耐热性dna聚合酶，分子量94kda，在镁离子存在的条件下，其最适反应温度为75-80℃，在95℃下的活性半衰期为40分钟，具有5’-3’核酸外切酶活性。由于其具有耐高温的特性，因此广泛用于聚合酶链式反应(pcr)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。商品化taq酶使用大肠杆菌原核表达系统进行克隆及表达。现代分子生物检测技术对pcr反应的灵敏度、精确度、耐用性要求越来越高，野生型taq酶无法完全满足实际应用的需求。为使其更加适应特定技术的使用，对taq酶序列的突变改造进行了很多的尝试，如添加dna结合结构域使其具有更强的延伸活性(wang y(2004).a novel strategy to engineer dna polymerases for enhanced processivityand improved performance in vitro.nucleic acids res 32,1197–1207))；通过定点突变、删除结构域使其具有更高的保真性(suzuki m,yoshida s,adman et,blank a,loeb la(2000)thermus aquaticus dna polymerase i mutants with alteredfidelity.interacting mutations in the o-helix.j biol chem275:32728–32735)、更高的dna聚合活性(mutant taq dna polymerases with improved elongation abilityas a useful reagent for genetic engineering.front microbiol 5:461.doi:10.3389/fmicb.2014.00461)、耐受高浓度抑制剂(zhang z,kermekchiev mb,barnes wm(2010)direct dna amplification from crude clinical samples using a pcrenhancer cocktail and novel mutants of taq.j mol diagn 12:152–161)、降低5’-3’核酸外切酶活性(vainshtein i,atrazhev a,eom sh,elliott jf,wishart ds,malcolmba(1996)peptide rescue of an n-terminal truncation of the stoffel fragment oftaq dna polymerase.protein sci 5:51785–51792)。

2、对taq酶的改造主要有以下几种途径。1：增加结构域，使其具有新的性能。如加入单链结合结构域(ssb)或dna结合蛋白sso7，增强taq酶对引物及模板dna的结合能力，使其具有更强的延伸能力和持续合成能力，适合用于长片段dna的扩增反应。但增加结构域会直接增大taq酶的分子量，有可能使taq酶的溶解性和稳定性降低。降低原核表达生产的产量。2：去除taq酶上非必要的结构域。如将5’-3’核酸外切酶结构域(taq酶n端前280个氨基酸)删除，使taq酶只保留核酸聚合酶活性区域，降低高浓度taq酶对引物及模板dna造成降解的可能性，达到提高taq酶聚合活性的目的。但此方法得到的taq酶突变体没有了5’-3’核酸外切酶活性，不适合用于基于taq man探针法的定量pcr反应，可使用范围有限。3：定点突变法。对活性位点、镁离子结合位点、dna结合位点的氨基酸进行定点突变，提高各位点对底物、模板及引物的亲和力，从而提高对各种抑制剂的耐受性。由于蛋白质结构的复杂性，一些远离活性位点的氨基酸也有可能对酶的整体结构产生影响，因此只对特定几个活性中心位点的氨基酸进行突变，难以从整体上对酶进行改造。而且现有的计算机模拟技术难以预测各个位点突变对整体结构会产生什么影响，用定点突变法制备突变体以及进行突变体筛选的工作量非常大，而且效率低下，一些可能对活性有重大影响的位点无法被识别。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有高扩增活性的耐热dna聚合酶突变体。

2、在本发明的第一方面，提供了一种突变的dna聚合酶，所述突变的dna聚合酶在选自下组的一个或多个位点发生突变：v453、f495、e507、k508、t509、a518、s624、y672、e734、r737、f749、t757、l764、h785，其中，氨基酸残基编号采用seq id no.2所示的编号。

3、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶的活性是野生型dna聚合酶(seq id no.:2)的至少1.5倍；优选地至少2倍；更优选地至少3倍。

4、在另一优选例中，所述野生型dna聚合酶的氨基酸序列如seq id no.:2所示。

5、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶的氨基选序列与seq id no.2相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

6、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶选自下组的突变体1-20：

7、 突变体编号 突变氨基酸 1 e507a，k508l，e734e，f749k 2 k508l、v453a、r737k 3 e734g 4 f749g k508l l764k 5 e507q、t757s 6 h785g 7 s624t f749v 8 e734f f749v 9 k508l r737w y672r 10 e507h h785l 11 a518q e734m 12 f495r f749t 13 k508l f749t e734f 14 r737p s624k 15 t757w v453g e507m 16 f749e h785g f495g 17 e734f y672p 18 t509l h785k 19 e734g t757s l764q 20 k508l v453a a518q。

8、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶中突变位点的数量为1-4个，优选为2或3个。

9、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶选自表2中的各具体突变体酶。

10、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶包括表2中的各具体突变体酶的突变位点。

11、在另一优选例中，所述突变的dna聚合酶在seq id no.:2所示的野生型dna聚合酶基础上进行突变，并且所述突变的dna聚合酶包括选自下组的突变位点：

12、(1)e507a、k508l、e734e、f749k；

13、(2)k508l、v453a、r737k

14、(3)e734g

15、(4)f749g、k508l、l764k

16、(5)e507q、t757s

17、(6)h785g

18、(7)s624t、f749v

19、(8)e734f、f749v

20、(9)k508l、r737w、y672r

21、(10)e507h、h785l

22、(11)a518q、e734m

23、(12)f495r、f749t

24、(13)k508l、f749t、e734f

25、(14)r737p、s624k

26、(15)t757w、v453g、e507m

27、(16)f749e、h785g、f495g

28、(17)e734f、y672p

29、(18)t509l、h785k

30、(19)e734g、t757s、l764q；和

31、(20)k508l、v453a、a518q。

32、本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本发明第一方面所述的突变的dna聚合酶。

33、本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

34、本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第一方面所述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子。

35、在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。

36、在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。

37、在另一优选例中，所述真核细胞为酵母细胞。

38、本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的突变的dna聚合酶的方法，包括步骤：

39、(i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的突变的dna聚合酶；和

40、(ii)分离所述的突变的dna聚合酶。

41、在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃；优选为25℃-37℃，如35℃。

42、本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的突变的dna聚合酶。

43、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。