一种基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料及其制备方法和应用

本发明属于生物，具体涉及一种基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、分子生物学领域中，核酸分析是一项至关重要的任务，涉及dna和rna的检测、分离和定量。核酸染料在这一过程中扮演着关键的角色，用于标记核酸分子，以便进行电泳、pcr、qpcr和其他核酸相关实验。然而，传统的核酸染料在使用中存在一些问题，如毒性、操作复杂性、敏感性、特异性、兼容性、浓度要求、稳定性和光学性能等。

2、目前已开发了一些核酸染料能够解决核酸分析的需求问题，但它们仍存在一些局限性。例如，传统的核酸染料，常用的核酸染料溴化乙锭(ethidium bromide，eb)，eb是一种传统核酸染料，广泛用于电泳分析。然而，它具有潜在的毒性，对人类健康和环境带来危害，且废物处理变得复杂而昂贵，需要特殊处理，对操作人员和环境造成风险。sybr green系列染料：sybr green染料是一组广泛使用的核酸染料，它们相对较安全，但对于某些核酸具有较低的特异性，这可能导致分析结果的误差，或者限制了实验的适用范围。gelred和gelgreen染料：这些染料是对eb的替代品，它们在某种程度上减轻了毒性问题，但在某些情况下仍然需要进行后处理。cybergreen染料：这种染料在qpcr等实验中广泛使用，但其特异性和操作要求仍然存在改进空间。dna胶中直接可成像染料：已有核酸染料可以直接添加到dna凝胶中，然后在凝胶成像仪中进行成像，省去了后处理步骤，但其稳定性和兼容性仍然需要改进。

3、综上，现有技术中部分核酸染料可能缺乏足够的敏感性和特异性，导致对核酸分子的检测和分析不够精确。这可能会引发误导性的实验结果，影响科学研究的准确性和可重复性。另外，一些核酸染料在使用时需要复杂的操作步骤，如预染、染色前后处理，使实验流程复杂而耗时。这不仅增加了工作量，还降低了实验效率。此外，兼容性问题也制约了核酸染料的广泛应用，某些染料可能无法在特定的分子生物学实验技术中使用，限制了其适用范围。最后，染料的稳定性和光学性能问题可能影响结果的准确性和可重复性，需要更稳定和一致的染料以提高分子生物学实验的质量。

4、虽然，已经有一些核酸染料用于分子生物学实验，但它们仍然存在一些技术问题和限制，包括毒性、特异性、操作复杂性和稳定性等方面。因此，需要提供一种更安全、更有效、更便捷的新型核酸染料，以满足分子生物学领域对核酸分析的不断增长的需求。

技术实现思路

1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料及其制备方法和应用。本发明中的新型基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料，能满足分子生物学领域对更安全、更精确、更便捷、更高效、更兼容、更经济且更稳定的核酸分析需求。本发明开发这种新型染料，可以减少毒性，提高特异性和敏感性，简化操作流程，扩展兼容性，减少浓度要求，提高稳定性，以及提供更加优秀的光学性能，从而改善核酸分析的效率和可行性，同时降低对实验人员和环境的潜在危害。为分子生物学研究提供更好的核酸染料选择，以促进科学研究的进展和实验的成功。

2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料，所述核酸染料选自具有如式i或式ii所示结构的化合物、其盐或其异构体：

4、

5、其中，x+选自氧或硫；y-为单价阴离子；n选自0、1、2、3、4或5；m选自羟基、碱金属或n-羟基丁二酰亚胺。

6、优选地，所述y-选自：f-、cl-、br-、i-、clo4-、pf6-或bf4-。

7、第二方面，本发明提供一种第一方面所述的基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料的制备方法，所述制备方法包括：将酸酐与4-n,n-二甲胺基苯甲酮在含有无机酸的条件下，发生缩合环化反应来形成吡啶环，得到吡喃盐结构的核酸染料，将所述吡喃盐结构的核酸染料与硫化氢反应，硫替代氧，从而生成相应的硫吡啶盐结构的核酸染料。

8、优选地，所述酸酐选自乙酸酐和/或环戊二酸酐。

9、优选地，所述无机酸选自硫酸、盐酸、硝酸或磷酸中任意一种或至少两种的组合。

10、优选地，所述制备方法包括：在温度低于50℃的条件下将酸酐加入无机酸中，再将反应混合物进行加热反应；反应后，再加入酸酐和4-n,n-二甲胺基苯甲酮，并进行加热反应，得到吡喃盐结构的核酸染料；将所述吡喃盐结构的核酸染料与硫化氢反应，硫替代氧，从而生成相应的硫吡啶盐结构的核酸染料。

11、优选地，所述酸酐和无机酸的反应混合物加热反应的条件为：加热至75±5℃(例如可以是70℃、72℃、74℃、75℃、76℃、78℃或80℃等)，进行3-4h的反应(例如可以是3h、3.5h或4h等)。

12、优选地，所述酸酐与无机酸的体积比为100:(25-35)，例如可以是100:25、100:26、100:28、100:30、100:32、100:34或100:35等。

13、优选地，所述酸酐和4-n,n-二甲胺基苯甲酮后加热反应的条件为：加热至45±5℃(例如可以是40℃、42℃、44℃、45℃、46℃、48℃或50℃等)，进行20-26h的反应(例如可以是20h、22h、24h或26h等)。

14、优选地，所述酸酐和4-n,n-二甲胺基苯甲酮的体积比为1:(2-3)，例如可以是1:2、1:2.5或1:3等。

15、优选地，所述吡喃盐结构的核酸染料与硫化氢反应的条件为：20-25℃(例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃等)反应5-10min(例如可以是5min、6min、7min、8min、9min或10min等)。

16、优选地，所述吡喃盐结构的核酸染料与硫化氢的质量比为1:(1-20)，例如可以是1:1、1:5、1:10、1:15或1:20等。

17、优选地，在20-26h的加热反应后，还包括诱发吡啶盐或吡喃盐的结晶的步骤。

18、本发明中，吡啶化合物的制备包括通过将相应的酸酐如：乙酸酐，环戊二酸酐等等，与4-n,n-二甲胺基苯甲酮，在酸性条件下，如：硫酸、盐酸、硝酸或者磷酸等，发生缩合环化反应来形成吡喃盐结构的核酸染料。还可以再采用硫替代氧，从而生成相应的硫吡啶化合物。

19、第三方面，本发明提供一种核酸成像探针，所述核酸成像探针包括第一方面所述基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料。

20、本发明中，吡喃盐和硫吡啶盐类化合物可通过将其羧基与核酸上具有反应性的功能基团发生反应，或者由于其独特结构特性可以与核酸发生特异性结合，从而轻松地将核酸标记。这种标记不会显著影响该类化合物的光学特性，从而有助于核酸的正确识别和数量测定。使用这种吡啶化合物标记的核酸可以用作dna探针，尤其是单链dna，具有特定的碱基序列。这种探针在核酸分析和检测中非常有用，尤其是在凝胶电泳、pcr、qpcr以及等温pcr等应用中。

21、本发明中，这种新型硫吡啶盐和吡喃盐化合物在标记核酸时，可以避免对生物样本的伤害，因为它不需要使用紫外线(uv)光作为激发光源，只需要在561nm激发光源的条件安全处理，从而使其在处理活细胞时更具优势。

22、本发明中，这种硫吡啶盐和吡喃盐化合物标记的核酸可以用作细胞核成像，无论是活细胞还是死细胞均可以进行染色。尤其是在细胞核内的核仁进行成像等中的应用。

23、第四方面，本发明提供第一方面所述的基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料在制备核酸探针中的应用。

24、第五方面，本发明提供第一方面所述的基于硫吡啶盐和吡喃盐结构的核酸染料在核酸电泳中的应用；

25、所述电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳或琼脂糖凝胶电泳。

26、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

27、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

28、1.保持光学特性：本发明的硫吡啶盐和吡喃盐化合物在与核酸反应或结合后能够保持其原始的光学特性，包括吸收和荧光特性。与某些其他标记剂相比，不会导致光学特性的显著变化。这意味着在标记核酸后，可以更准确地进行光谱分析，而不需要重新校准荧光检测器。

29、2.避免生物损伤：与一些传统标记剂不同，本发明的硫吡啶盐和吡喃盐化合物不需要紫外线(uv)光来激发，因此在处理活细胞时，不会对它们造成伤害。这是对细胞和生物样本更加友好的方法。

30、3.水溶性强：本发明的硫吡啶盐和吡喃盐化合物在水溶液中具有高度的溶解度，因为它带有高度亲水性的基团。相对于那些需要有机溶剂的标记剂，这种化合物可以在有机溶剂含量低于10％的水溶液中使用，这有助于维持双链核酸的稳定性，尤其是在生物样本中。

31、4.dna探针应用：本发明的硫吡啶盐和吡喃盐化合物可以作为dna探针，用于特定核酸序列的检测。这为核酸分析和检测提供了更多的应用可能性。

32、5.细胞核成像：本发明的硫吡啶盐和吡喃盐化合物可以作为细胞核成像探针，用于细胞核中的核仁成像。可以动态观测细胞核的动态变化。

33、总之，本发明的主要优点包括保持光学特性，避免生物损伤，高度可溶性以及用于dna探针的应用。这些优点使该技术相对于现有技术更具吸引力，尤其是在核酸标记和检测领域。