一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物医药，具体地，涉及一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体及其应用，更具体地，所述单克隆抗体为f3。

背景技术：

1、鼠疫(plague)是一种由鼠疫耶尔森菌(yersinia pestis，简称鼠疫菌)引起的自然疫源性疾病，全世界有各种类型的动物自然疫源地，难以彻底消除。鼠疫可造成非常严重的人类疾病，特别是败血性(细菌通过血液循环引起全身感染)鼠疫和肺鼠疫，如果不加治疗，病死率为30％-100％。此外，鼠疫菌被列为重要的生物战剂和生物恐怖剂，一直受到高度重视。《中华人民共和国传染病防治法》规定鼠疫属于甲类传染病，执行最严格的防控。美国疾病预防控制中心则将鼠疫耶尔森菌归类为易传染、高致死率、可引起公众恐慌和社会动荡，需要进行特别公共卫生准备的a类微生物病原体。近年来随着国际反恐斗争的需要，对鼠疫的防治研究已成为国际生物医学界的研究热点之一。

2、目前鼠疫的治疗依靠抗菌素，多种抗生素对鼠疫有效，链霉素被认为是治疗鼠疫最有效的传统药物之一。但是基于新的多药抗性鼠疫菌的出现，1970年世界卫生组织鼠疫专业委员会建议研发新的替换药物。因此，研制抗生素之外的鼠疫治疗药物迫在眉睫。中和性单克隆抗体被认为是具有应用前景的特异性治疗药物，因为其靶标和作用机制明确，研制相对容易，是目前较为切实可行的办法。研究显示，f1(fraction1，f1)抗原是位于鼠疫菌体表面荚膜物质，由100kbp的pfra质粒编码，是鼠疫菌的特异性抗原之一。鼠疫感染的免疫保护机制中，f1抗血清在动物体内显示了明显的保护效果。因此，筛选f1抗原单抗有可能获得具有保护效果的中和性单抗，并用于鼠疫的特异性治疗。

技术实现思路

1、本发明采用单克隆抗体技术筛选得到了对鼠疫耶尔森菌f1抗原具有高亲和力和高特异性的全人源中和性单克隆抗体f3，并通过动物实验进行了验证，验证结果表明所述单克隆抗体f3能够有效阻断鼠疫耶尔森菌强毒株的致病作用。本发明为本领域提供了一种全新的针对鼠疫耶尔森菌的全人源保护性单克隆抗体f3。

2、本发明采用如下技术方案实现上述目的：

3、本发明的第一方面提供了一种全人源针对鼠疫菌的保护性单克隆抗体。

4、进一步，所述单克隆抗体包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中，所述vh包含氨基酸序列如seq id no:4所示的vh中的hcdr1-3，所述vl包含氨基酸序列如seq id no:9所示的vl中的lcdr1-3。

5、进一步，所述hcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:1-3所示，所述lcdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no:6-8所示。

6、进一步，所述vh的氨基酸序列如seq id no:4所示或与seq id no:4具有至少80％同一性，所述vl的氨基酸序列如seq id no:9所示或与seq id no:9具有至少80％同一性。

7、在本发明中，与本发明所述单克隆抗体的vh对应的氨基酸序列、vl对应的氨基酸序列、hcdr1-3对应的氨基酸序列或lcdr1-3对应的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性、并保持特异性结合鼠疫耶尔森菌f1抗原和/或中和鼠疫耶尔森菌感染的能力的序列对应的抗体均在本发明的保护范围内。

8、在本发明中，所述hcdr1-3的氨基酸序列并不局限于如seq id no:1-3所示的氨基酸序列，所述lcdr1-3的氨基酸序列并不局限于如seq id no:6-8所示的氨基酸序列，本领域技术人员公知不同cdr编号方案对同一vh或vl中的cdr1、cdr2、cdr3进行定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的氨基酸序列会存在一定的差异性，因此，采用任何cdr编号方案对本发明如前所述的vh和vl中的cdr1、cdr2、cdr3进行定义得到的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2、lcdr3对应的氨基酸序列或核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

9、在一些实施方案中，所述cdr编号方案包括但不限于：imgt编号方案、chothia编号方案、kabat编号方案、contact编号方案、martin(增强型chothia)编号方案、abm编号方案、aho编号方案中的任意一种或任意多种(两种或两种以上)组合。

10、本发明的第二方面提供了一种缀合物。

11、进一步，所述缀合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体。

12、在一些实施方案中，所述缀合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体以及一种或多种额外的分子或试剂(以下称为二级分子或试剂)。所述单克隆抗体可以缀合到任何类型的合成或天然二级分子或试剂，例如：肽、蛋白质、糖类/多糖、脂质、天然存在或合成的聚合物/共聚物等，以修饰单克隆抗体的一种或多种性质。

13、在一些实施方案中，所述缀合物还包含单克隆抗体和与其缀合的分子之间的共价连接或键。该分子可以直接缀合到单克隆抗体上，或者通过接头间接缀合。接头可以是包含一个或多个氨基酸的多肽接头或另一种类型的化学接头(例如：碳水化合物接头、脂质接头、脂肪酸接头、聚醚接头、peg等)。

14、在一些实施方案中，所述二级分子或试剂可以缀合/连接到单克隆抗体的一个氨基酸的侧链。将分子或试剂缀合到氨基酸侧链的方法在本领域是众所周知的。例如，与赖氨酸残基侧链中存在的伯胺反应的化学基团，如异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基叠氮化物、nhs酯、磺酰氯、醛、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷、碳酸盐、芳基卤化物、酰亚胺、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯可以用于将分子或试剂缀合到单克隆抗体上。这些基团中的大多数通过酰化或烷基化与胺共轭。单克隆抗体中存在的半胱氨酸残基也可用于连接分子。

15、在一些实施方案中，所述单克隆抗体被标记或与一个或多个部分缀合。单克隆抗体可以用一种或多种标记物标记，例如生物素标记物、荧光标记物、酶标记物、辅酶标记物、化学发光标记物或放射性同位素标记物。

16、在一些实施方案中，所述单克隆抗体用可检测的标记物标记。有用的可检测标记物包括荧光化合物(例如：异硫氰酸荧光素、得克萨斯红、罗丹明、荧光素、alexa染料等)、放射性标记物、酶(例如：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和其他常用于蛋白质检测分析的物质)、链霉亲和素/生物素和比色标记物(例如：胶体金、彩色玻璃或诸如聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶等的塑料珠)。也可以使用化学发光化合物。这种标记的单克隆抗体可用于通过流式细胞术、免疫组织化学等检测鼠疫耶尔森菌感染的细胞。

17、在一些实施方案中，所述单克隆抗体也可以与可检测或亲和标签缀合，所述可检测或亲和标签促进单克隆抗体的检测和/或纯化。这样的标签在本领域中是众所周知的。可检测或亲和标签的例子包括但不限于：多组氨酸标签(his标签)、多聚精氨酸标签、聚天冬氨酸盐标签、多聚半胱氨酸标签、聚苯丙氨酸标签、谷胱甘肽s-转移酶(gst)标签、麦芽糖结合蛋白(mbp)标签、钙调素结合肽(cbp)标签、链霉亲和素/生物素基标签、profinity标签、表位标签(如flag、血凝素(ha)、hsv、s/s1、c-myc、kt3、t7、v5、e2和glu-glu表位标签)。

18、本发明的第三方面提供了一种核酸分子。

19、进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的单克隆抗体；

20、优选地，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的vh的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:5所示；

21、优选地，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的vl的核酸分子的核苷酸序列如seq id no:10所示。

22、在一些实施方案中，分离的核酸可以是合成dna、mrna(例如：非天然存在的mrna)或cdna。核酸可以插入质粒、载体或转录或表达盒中。可以制备编码本发明所述单克隆抗体的核酸，并且可以使用本领域熟知的常规技术来测试所述表达的单克隆抗体。

23、在一些实施方案中，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核酸可以保留在宿主细胞中的载体中。在另一些实施方案中，编码本发明第一方面所述的单克隆抗体的核酸(dna、mrna)包含在囊泡内，例如脂质纳米颗粒(例如脂质体)或任何其他合适的载体。在另一些实施方案中，核酸是mrna，并且被封装到纳米颗粒递送载体中。

24、本发明的第四方面提供了一种表达载体。

25、进一步，所述表达载体包含本发明第三方面所述的核酸分子。

26、在一些实施方案中，本发明所述的表达载体是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是质粒，质粒是指一个环状的双链dna环，额外的dna片段可以连接到该环中。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的dna片段可以连接到病毒基因组中。

27、在一些实施方案中，某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其操作性连接的基因的表达。此类载体在本文中称为重组表达载体。

28、本发明的第五方面提供了一种宿主细胞。

29、进一步，所述宿主细胞包含本发明第四方面所述的表达载体。

30、在本发明中，所述宿主细胞是指导入外源dna的细胞。所述宿主细胞不仅是指特定的受试细胞，而且是指这样的细胞的后代。由于突变或环境影响，某些修饰可能会在后代中发生，因此这些后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包含在本发明所述的宿主细胞的范围内。

31、在一些实施方案中，所述宿主细胞包括选自任何生物界的原核细胞和真核细胞。为了重组产生抗体，将编码本发明如前所述的单克隆抗体的轻链和重链的一种或多种核酸引入能够产生重组抗体的细胞中。

32、在一些实施方案中，所述宿主细胞的实例包括但不限于：cho-k1、dukxb11、pro-5、cho-s、小鼠骨髓瘤细胞nso、小鼠骨髓瘤细胞sp2/0-ag14、大鼠骨髓瘤细胞yb2/0、小鼠p3-x63-ag8653细胞、二氢叶酸还原酶基因缺陷的cho细胞、凝集素抗性获得的lec13、α1,6-岩藻糖基转移酶基因缺陷的cho细胞、大鼠yb2/3hl.p2.g11.16ag.20细胞、cho-3e7细胞等。

33、本发明的第六方面提供了如下任一种产品：

34、(1)一种混合物，所述混合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；

35、(2)一种药物组合物，所述药物组合物包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；

36、(3)一种药物制剂，所述药物制剂包含所述药物组合物；

37、(4)一种检测试剂，所述检测试剂包含本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子和/或本发明第五方面所述的宿主细胞；

38、(5)一种检测试剂盒，所述检测试剂盒包含所述检测试剂。

39、在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂还包含药学上可接受的载体/赋形剂，所述载体/赋形剂可适用于通过任何常规给药途径施用所述单克隆抗体或编码所述单克隆抗体的核酸，例如口服、静脉内、胃肠外、皮下、肌肉内、颅内、眶内、眼科、室内、囊内、椎管内、鞘内、硬膜外、脑鞘内、腹膜内、鼻内或肺(如气雾剂)给药等。

40、在一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过静脉内或皮下途径施用所述单克隆抗体。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过静脉内途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过皮下途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。在另一些实施方案中，所述载体/赋形剂适于通过肺途径施用所述单克隆抗体、或编码所述单克隆抗体的核酸。

41、在一些实施方案中，所述药物组合物或药物制剂中还可包含一种或多种用于治疗鼠疫耶尔森菌感染相关疾病/病症或用于控制鼠疫耶尔森菌感染相关疾病/病症的额外活性剂，所述额外活性剂包括但不限于：止痛药、止呕药、抗炎剂、止泻剂、止咳剂、退烧药、免疫治疗剂等。

42、本发明的第七方面提供了如下任一种方法：

43、(1)一种本发明第一方面所述的单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：培养本发明第五方面所述的宿主细胞，从宿主细胞培养产物中分离得到本发明第一方面所述的单克隆抗体；

44、(2)一种本发明第五方面所述的宿主细胞的制备方法，所述方法包括：将本发明第四方面所述的表达载体引入到宿主细胞中，得到本发明第五方面所述的宿主细胞；

45、(3)一种体外抑制鼠疫耶尔森菌f1蛋白活性的方法，所述方法包括：将本发明第四方面所述的表达载体引入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的单克隆抗体抑制鼠疫耶尔森菌f1蛋白的活性；

46、(4)一种体外使鼠疫耶尔森菌f1蛋白失活的方法，所述方法包括：将目标样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体接触；

47、(5)一种非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌f1蛋白的方法，所述方法包括：将待测样品与本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第六方面中所述的检测试剂接触，检测f1蛋白与抗体免疫复合物的形成。

48、在一些实施方案中，将目的核酸引入宿主细胞可以使用本领域熟知的技术来完成。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、deae葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染，以及使用逆转录病毒或其他病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入后可以引起或允许核酸表达，例如通过在基因表达的条件下培养宿主细胞。

49、本发明的第八方面提供了如下任一种应用：

50、(1)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明的第五方面所述的宿主细胞在制备用于检测鼠疫耶尔森菌f1蛋白的检测试剂中的应用；

51、(2)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的检测试剂在制备用于检测鼠疫耶尔森菌f1蛋白的检测试剂盒中的应用；

52、(3)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的抗体衍生物中的应用；

53、(4)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体和/或本发明第五方面所述的宿主细胞在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的药物组合物中的应用；

54、(5)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞和/或本发明第六方面中所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的药物制剂中的应用；

55、(6)本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的检测试剂和/或本发明第六方面中所述的检测试剂盒在非诊断和非治疗目的地检测鼠疫耶尔森菌f1蛋白中的应用。

56、本发明还提供了一种诊断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的方法，所述方法包括：将本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第六方面中所述的检测试剂和/或本发明第六方面中所述的检测试剂盒与受试者来源的待测样品接触，检测受试者来源的待测样品中是否存在f1蛋白，进而判断受试者是否患有鼠疫耶尔森菌感染相关疾病或患鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的风险。

57、本发明还提供了一种在有需要的受试者中治疗和/或预防鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的方法，所述方法包括：向所述有需要的受试者施用有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的药物组合物和/或本发明第六方面中所述的药物制剂。

58、本发明还提供了一种降低受试者患鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的风险或鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的严重程度的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的本发明第一方面所述的单克隆抗体、本发明第二方面所述的缀合物、本发明第五方面所述的宿主细胞、本发明第六方面中所述的药物组合物和/或本发明第六方面中所述的药物制剂。

59、相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

60、本发明为本领域提供了一种全人源针对鼠疫耶尔森菌f1抗原的高保护性、高特异性和高亲和力的单克隆抗体，f1抗原是鼠疫耶尔森菌表达的特异性蛋白，因此，本发明提供的单克隆抗体可应用于鼠疫耶尔森菌感染相关疾病的诊断、治疗及预防研究中，具有重要的应用前景。