一种烟草茉莉酸信号调控因子NbNINJA13及其克隆方法与应用

本发明属于遗传工程，具体涉及烟草茉莉酸信号负调控因子的鉴定及其克隆方法与在培育低尼古丁含量烟草中的应用。

背景技术：

1、ja(茉莉酸)信号通路是调控植物次生代谢的重要途径，jas(茉莉素)能诱导植物细胞产生多种次生代谢产物，例如尼古丁和黄酮类化合物等，这些次生代谢产物种类繁多，是植物防御系统的重要组成部分。尼古丁在烟草根中合成，并通过木质部或韧皮部从根向上运输到气生组织。在烟草中，jas可通过调控尼古丁的合成，介导烟草对虫害、病菌等的抗性。尼古丁含有一个吡啶环和一个吡咯烷环，分别由天冬氨酸和鸟氨酸经多个酶反应衍生而来，并且受特异调控因子控制。jas主要通过coi1-jaz-myc2-nic2erfs信号转导方式调控烟草尼古丁合成通路关键基因的转录。烟草中有两个调控位点专门控制尼古丁相关结构基因的表达，分别是nic1和nic2；而烟草尼古丁合成通路关键基因pmt、a622、qpt、qs以及bbl等均受nic位点调控。解析尼古丁生物合成调控具有重要的现实意义和科学价值。

2、烟草是我国重要经济作物之一，作为烟草属物种中主要的生物碱，尼古丁可作用于神经系统，使得吸烟者成瘾。尼古丁影响身体的许多器官包括心脏、大脑、血管和内分泌系统，危害身体新陈代谢。因此筛选和鉴定低尼古丁含量的烟草品种具有重要意义，不仅能为巨大的烟草消费市场提供多样化的选择，而且在对抗尼古丁成瘾方面具有潜在的应用价值。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13。

2、本发明还要解决的技术问题其提供上述烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的克隆方法。

3、本发明最后要解决的技术问题是提供上述烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13在构建转基因烟草新品种中的应用。

4、为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

5、一种烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13，其基因编码序列如seq id no.1所示。

6、其中，所述的烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13能够负向调控尼古丁生物合成。

7、一种烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的编码蛋白，其氨基酸序列如seq idno.2所示。

8、其中，所述的编码蛋白来源于ninja家族相关蛋白，其含有能够介导与tpl蛋白互作的ear保守结构域和与jaz蛋白互作的tify保守结构域。

9、上述烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的克隆方法，包括以下步骤：

10、(1)烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的确定：通过生物信息学分析筛选本氏烟草中候选的烟草茉莉酸信号调控因子，并通过蛋白互作验证获得候选基因nbninja13；根据本氏烟草转录组信息获得nbninja13编码基因序列；

11、(2)提取本氏烟草总rna，再反转录获得cdna；

12、(3)以步骤(2)的cdna为模板，pcr扩增克隆候选基因nbninja13，再回收和纯化pcr扩增产物，并测序。

13、其中，步骤(1)中，所述的通过生物信息学分析筛选本氏烟草中候选的烟草茉莉酸信号调控因子，具体是先从蛋白结构域数据库(http://pfam.xfam.org)中搜索并下载模式植物拟南芥atninja蛋白的保守结构域：pf07897(ethylene-responsive binding factor-associated repression，即ear motif)和pf16135(tify domain binding domain)。其中，pf07897“ear motif”可介导atninja与attpl蛋白互作；而pf16135“tify domain bindingdomain”是负责atninja与jazs相互作用所必需的结构域。之后利用hmmer search工具在本氏烟草蛋白数据库(https://btiscience.org/our-research/research-facilities/research-resources/nicotiana-benthami ana/)中检索同时含有这两个保守结构域的编码蛋白，其编码基因可作为本氏烟草nbninja候选基因。

14、具体的，在本氏烟草蛋白数据库中共筛选到nbninja候选基因13个，分别为：nbninja1～13，优选nbninja13。

15、其中，步骤(1)中，通过蛋白互作验证获得候选基因nbninja13，首先将筛选的13个本氏烟草候选基因的编码蛋白与atninja，naninja进行系统进化的同源性分析，发现nbninja13与拟南芥atninja同源性最高，分布在同一分支，暗示两者可能具有相似的功能。然后利用酵母双杂交、双分子荧光互补实验进一步验证nbninja13蛋白相互作用，发现nbninja13与attpl、atjaz2之间存在蛋白相互作用，这一结果与对照组atninja与attpl、atjaz2之间存在蛋白相互作用相类似，因此，根据保守蛋白结构域的功能相似性，推测nbninja13与atninja功能相似。接着对本氏烟草nbninja13蛋白重要结构域，即介导与tpl互作的ear结构域(ear motif)和与jaz互作的tify结构域(tify domain binding domain)进行鉴定与功能分析，发现nbninja13的保守结构域介导其与jaz和tpl间的蛋白相互作用。最终确定烟草茉莉酸信号调控因子nbninja的候选基因为nbninja13。

16、其中，步骤(2)中，所述的反转录，其反应体系如下：rna 50ng-5μg、oligo(dt)1μl、2x ts reaction mix 10μl、rt/ri enzyme mix 1μl、gdna remover 1μl、rnase-freewater to 20μl；反转录程序为：42℃30min，85℃5min。

17、其中，步骤(3)中，所述的pcr扩增克隆候选基因nbninja13，其所用引物为：bd-nbninja13-fp和bd-nbninja13-rp。

18、一种过表达载体，含有上述烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的基因编码序列，也在本发明所保护的范围之内。

19、具体的，所述的过表达载体为nbninja13过表达载体，扩增nbninja13并构建至pcambia1302载体中，所用引物为oe-ninja13-fp和oe-ninja13-rp。

20、上述烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13或烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13的编码蛋白在构建转基因烟草新品种中的应用也在本发明所保护的范围之内。

21、其中，所述的转基因烟草新品种为尼古丁含量显著降低的转基因烟草nbninja13-oe。

22、其中，所述的转基因烟草新品种，其获得方法为：克隆烟草茉莉酸信号调控因子nbninja13，利用农杆菌介导的烟草叶盘转化法构建烟草nbninaj13过表达转基因烟草，筛选获得尼古丁含量降低的转基因烟草新品种。

23、进一步的，通过对nbninja13-oe过表达转基因烟草得尼古丁合成通路相关基因nbpmt，nba622以及nbqprt的转录水平进行分析，发现nbpmt，nba622以及nbqprt响应meja的应答，基因转录水平随着meja的处理而上调；但其基因转录水平的上调比率明显低于野生型烟草wt。此外，实验还发现在正常生长情况下，过表达转基因烟草中nbpmt，nba622以及nbqprt转录水平也明显低于wt。随后，利用gc-ms对烟草的尼古丁含量进行检测，发现在正常生长情况下nbninja13过表达转基因烟草根部的尼古丁含量明显低于野生型烟草wt，降低了57.1％；而经meja处理后，烟草中的尼古丁含量明显升高，而nbninja13-oe中尼古丁含量也明显低于wt，其含量为wt的0.58倍；此外，叶片中过表达烟草尼古丁含量也显著低于wt，其含量为wt的0.38倍。以上结果表明nbninja13负调控本氏烟草中尼古丁的合成。

24、有益效果：

25、本方案以本氏烟草为主要研究对象，利用生物信息学方法筛选得到了nbninja候选基因nbninja13，并通过生物化学、植物分子遗传学中的酵母双杂交、双分子荧光互补等手段进行功能验证，克隆获得了本氏烟草茉莉酸信号负调控因子nbninja13基因，并探讨了nbninja13对尼古丁合成的负调控机制，筛选得到了低尼古丁含量转基因烟草品种。说明本氏烟草茉莉酸信号负调控因子nbninja13基因在培育低尼古丁含量的烟草品种方面具有较大的应用前景。