一种快速筛选耐盐碱油菜的引物组合及其应用的制作方法

本发明涉及生物育种领域，具体涉及一种快速筛选耐盐碱油菜的引物组合及其应用。

背景技术：

1、土壤盐碱化已成为制约我国粮油生产可持续发展的关键因子。土壤盐碱化是导致土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，对农业生产和生态环境带来巨大的负面影响。我国海岸线漫长，沿海滩涂的盐碱地也在日益增加。因此，修复和利用盐碱地具有重要的经济、生态和社会效益。油菜具有重要的油用、饲用、菜用以及旅游观光价值。作为食用植物油和植物蛋白的主要来源，油菜在我国农产品中占有重要地位，对于保障我国油料供给安全尤为重要。前期研究表明油菜中存在部分耐盐碱的油菜资源，并且能在在中国滨海高盐滩涂地和内陆盐碱地均能生长良好。同时，耐盐碱油菜具有“利用”与“改良”盐碱地相结合的特色，是改良利用盐碱地最有优势的大田作物。快速选择耐盐碱油菜新种质、利用耐盐碱油菜以及农牧结合等综合措施，是一种修复和利用盐碱地经济有效、可持续发展的途径。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本方案提供了一种快速筛选耐盐碱油菜的引物组合及其应用，在盐碱条件诱导下，利用植株早期的盐吸收相关基因mrna的表达变化筛选耐盐碱能力强油菜的方法，可以用于油菜耐盐碱能力的种质资源鉴定。

2、为达到上述目的，本方面首先提供了一种快速筛选耐盐碱油菜的引物组合，其特征在于，包括引物组合u1，引物组合u2、引物组合u3、引物组合u4、引物组合u5、引物组合u6、引物组合u7；

3、所述引物组合u1包括如seq id no.1所示的上游引物，如seq id no.2所示的下游引物；

4、所述引物组合u2包括如seq id no.3所示的上游引物，如seq id no.4所示的下游引物；

5、所述引物组合u3包括如seq id no.5所示的上游引物，如seq id no.6所示的下游引物；

6、所述引物组合u4包括如seq id no.7所示的上游引物，如seq id no.8所示的下游引物；

7、所述引物组合u5包括如seq id no.9所示的上游引物，如seq id no.10所示的下游引物；

8、所述引物组合u6包括如seq id no.11所示的上游引物，如seq id no.12所示的下游引物；

9、所述引物组合u7包括如seq id no.13所示的上游引物，如seq id no.14所示的下游引物。

10、基于一个总的发明构思，本方案还提供一种引物组合在筛选耐盐碱油菜上的应用，包括以下步骤：

11、s1、以待测油菜的种子为材料，表面灭菌，置于温室中接种于常规ms固体培养基上培养，设置对照组和处理组，其中处理组培养基含nacl；

12、s2、检测对照组和处理组的生物量，并提取根部或叶片的总rna，反转录后采用引物组合u1-u7进行定量pcr实验，对引物组合u1-u7进行基因表达的检测，以actin为参照基因；

13、若处理组检测的u1-u7基因较对照组都增加3.00倍及以上，且生物量大于等于对照组的95％，则判定该油菜为耐盐碱油菜。

14、作为优选，所述s1步骤中油菜为甘蓝型油菜或芥菜型油菜。

15、作为优选，所述s1步骤中温室条件为：日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200-250μmol m–2s–1。

16、作为优选，所述s1步骤中培养时间为10-15天。

17、作为优选，所述s1步骤中处理组培养基ph为7.5，所述nacl浓度为1.25％-1.5％。

18、作为优选，所述s2步骤中pcr实验程序如下：94℃预变性3min；94℃变性10s，52℃退火20s，72℃延伸10s，循环30次；72℃再延伸2min。

19、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

20、(1)本方案以盐碱诱导下表达上调的盐吸收基因序列为基础，设计引物，建立了反转录-定量pcr技术体系，在此基础上进行优化，建立了利用盐碱诱导下检测基因mrna的变化来快速选择耐盐的油菜植物的方法。

21、(2)本方案提供的检测方法快速、敏感和特异性强，节约了鉴定的时间和费用，提高了油菜植物耐盐性状的鉴定效率，具有很好的应用价值。

技术特征：

1.一种快速筛选耐盐碱油菜的的引物组合，其特征在于，包括引物组合u1，引物组合u2、引物组合u3、引物组合u4、引物组合u5、引物组合u6、引物组合u7；

2.一种如权利要求1所述的引物组合在筛选耐盐碱油菜上的应用，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述s1步骤中油菜为甘蓝型油菜或芥菜型油菜。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述s1步骤中温室条件为：日夜长比为16/8h，日夜温为22/16℃，光照强度为200-250μmolm–2s–1。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述s1步骤中培养时间为10-15天。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述s1步骤中处理组培养基ph为7.5，所述nacl浓度为1.25％-1.5％。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述s2步骤中pcr实验程序如下：94℃预变性3min；94℃变性10s，52℃退火20s，72℃延伸10s，循环30次；72℃再延伸2min。

技术总结
本发明公开了一种快速筛选耐盐碱油菜的引物组合及其应用，以耐盐碱的甘蓝型油菜为材料，把盐处理和对照材料在苗期进行转录组测序，获得表达量在根中增加3.0倍以上mRNA序列所对应的基因，分析这些基因表达量的变化与油菜耐盐的相关性，找到了7个基因在所有的处理组的表达量都增加了3.0倍以上、且表达量与耐盐性呈极显著正相关，确定这些基因为耐盐基因。用这7个基因的引物检测油菜幼苗在含NaCl的MS培养基中的基因表达的变化，当这7个耐盐基因在根中的表达量比对照都增加3.00倍以上的油菜，且生物量不低于对照的95％，就属于高耐盐碱的油菜；这种检测方法灵敏度高且特异性强，可以快速检测油菜的耐盐能力。

技术研发人员：严明理,焦茹玉,朱羿霖,谢其均,杨倩,谭文清,刘新红,邓力超,周兴,李莓
受保护的技术使用者：湖南省作物研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/3/4