一种小反刍兽疫病毒的可视化RT-LAMP检测方法

本发明涉及兽用生物制品，具体涉及一种小反刍兽疫病毒的可视化rt-lam p检测方法。

背景技术：

1、小反刍兽疫(peste des petits ruminants,ppr)是由小反刍兽疫病毒(pprvirus,pp rv)感染小型反刍类动物和部分大型反刍动物的一种急性高致死性病毒病，其临床症状主要为发烧、坏死性口炎、肺炎等，因其临床症状与牛瘟(rinderpest,rp)相似，故也曾称为伪牛瘟(pseudo-rinderpest)。pprv主要感染绵羊和山羊，疫情严重时可以导致绵羊和山羊100％的致死率，给全球羊产业造成了巨大的经济损失；同时，pprv可感染野生羊类动物如野山羊、小鹿瞪羚和长角羚等并导致批量死亡，给生物多样性带来严重威胁。鉴于该病危害严重，传染性极强，世界动物卫生组织(woah)将ppr规定为发病必须上报的动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。ppr被认为是制约小型反刍动物生产的主要因素之一，因此2012年，oie和联合国粮食及农业组织(fao)倡议将ppr纳入全球跨境动物疫病防控框架(gf-tads)，并制定了全球控制和根除计划目标——到2030年全球根除ppr。2022年，我国为进一步做好ppr消灭工作，农业农村部印发《国家动物疫病强制免疫指导意见(2022—2025年)》的通知，其中针对ppr的要求是强制对全国所有羊进行疫苗免疫。目前控制ppr传播只能使用减毒活疫苗作为预防手段，存在生物安全隐患和毒株变异的风险，因此建立快捷灵敏的可视化检测方法以及时发现疫情降低ppr的传播，同时研制更安全有效的新型疫苗是升级当前防控技术和手段的重要方向。总之，快速可视化检测方法和新型疫苗是有效防控ppr的重要技术支撑，这些技术的不断探索和创新将为小反刍动物养殖业的发展提供健康保障。

2、pprv属副黏病毒科麻疹病毒属，与同属病毒如犬瘟热病毒(cdv)、麻疹病毒(m v)、牛瘟病毒(rpv)等在基因组序列、病毒结构、生物学特性等方面具有高度相似性。pprv血清型只有一个，根据n或f基因可分为四个基因系(ⅰ系、ⅱ系、ⅲ系、ⅳ系)，目前全球范围内流行最为广泛的为ⅳ系(santhamani et al.,2016)。pprv粒子呈多形性，有囊膜，基因组为单股负链不分节段的rna。病毒基因组全长约为15948nt，遵循“六碱基规则”，在病毒基因组上依次分布着6个编码基因n、p、m、f、h、l，分别编码6种结构蛋白(n、p、m、f、h、l蛋白)及两个非结构蛋白(c、v蛋白)。核衣壳(n)蛋白包裹病毒基因组形成n-rna复合物，并与磷(p)蛋白、大(l)蛋白共同形成核蛋白复合体(rnp)参与病毒的复制。其中，p蛋白既与l蛋白构成病毒rna依赖性rna聚合酶(rdrp)参与病毒蛋白翻译，也能单独与n-rna模板复合物结合激活转录。此外，p基因还可通过可变阅读框和rna编辑编码c和v蛋白，c蛋白分布在感染细胞的细胞质中，可与l蛋白结合调节rna聚合酶的功能；v蛋白大部分分布在细胞质，少部分位于细胞核，参与病毒的复制和致病。基质(m)蛋白连接病毒核衣壳与囊膜，在病毒样颗粒(vlps)的形成过程中发挥关键作用。病毒囊膜结构由融合(f)蛋白和血凝素(h)蛋白这两种糖蛋白构成，f蛋白在h蛋白的辅助作用下，介导病毒囊膜和宿主细胞膜的融合，决定病毒能否感染宿主；h蛋白可与宿主细胞上的相应受体结合，决定病毒感染宿主细胞的特异性，且宿主产生的中和抗体也主要针对h蛋白。

3、抗原检测方法以病原分离培养和利用免疫学方法检测病毒蛋白的方法为主，这些方法均可准确鉴定动物或组织有无病原感染，而抗体检测方法则主要指检测病原特异性抗体的方法，可确定动物体内是否存在ppr特异性抗体，依此可判断疫苗接种效果或动物是否感染该病毒。除ppr抗原抗体检测方法外，在临床常见的还有pprv核酸检测方法。因为每种检测方法不仅在敏感性、特异性和检测效率上存在差异，在检测目的方面也有不同，所以在实际中应根据检测目的、样品类型等具体情况选择合适的检测方法，才可能得到最理想的检测结果，为该疫病防控提供参考。

4、抗原抗体检测方法虽然具有一定的灵敏度和特异性，能准确检测病原，但绝大多数方法比较费时费力，在实现快速检测方面存在一定的难度，且对样品的新鲜度有一定的要求；而病原核酸检测方法具有快速、灵敏、准确的特点，有些方法可以实现现场检测，检测时间也被有效缩短，且对样品要求低，可替代抗原抗体检测方法对病原准确检测。

5、cdna探针法是用放射性核素或非核素标记物标记dna分子制备成的核酸探针，与病毒核酸杂交进行检测的方法。在一定条件下(适当ph值、温度和离子强度)，与病毒核酸杂交进行检测的方法。最初，cdna探针能区分rpv与pprv，可进行活病毒检测但容易造成放射性污染且探针保存期短，检测时间需要2d，不适合快速检测。随后开发了生物素标记，无半衰期并且在60min内即可得到结果，但存在不稳定且灵敏度较低的缺陷。为了克服这一问题，开发了核酸扩增技术用于ppr诊断，如聚合酶链反应(pcr)。

6、聚合酶链式反应(rt-pcr)较免疫学方法而言，操作简单，特异性和灵敏度较高，耗时短且所需样品量少，是应用较为广泛的核酸检测方法。rt-pcr主要检测pprv的n、m、h、f基因等。常规pcr有假阳性或假阴性高的问题。为了解决这一问题，mahapa tra et al(2021)和朱小甫等(2020)通过再增加一对特异性引物对pcr产物二次扩增的方式建立了靶向pprvn和f基因的巢式rt-pcr(rt-npcr)方法，均比常规rt-pc r的特异性和灵敏性高，最低可以检测到101copies rna；rt-npcr对早期感染、隐性感染等病毒拷贝数较低的病例诊断具有重要意义，但其二次扩增容易引起交叉污染。此外，多重rt-pcr既可以针对单个病原多重扩增以提高检测的准确度，也可以对多种病原开展同时检测，提高检测效率，为诊断、流行病学调查等提供了方便。但多重rt-pcr缺点是操作较为复杂，容易污染，不适合高通量检测。

7、实时荧光定量pcr(rt-qpcr)可实时监测pcr进程并对起始核酸模板定量，是目前最为常用的pprv核酸检测方法。目前已建立了pprv n、m、f及h基因荧光染料法或taqman探针法的多种检测方法。染料法虽然使用方便，成本低，适合大规模检测，但容易出现假阳性；taqman探针法特异性和灵敏度更高，是目前使用最多的检测方法。为了提高检测效率，halecker et al(2020)利用磁珠提取核酸，建立了多病原检测通道的高速rt-qpcr法，有效简化了临床疾病诊断工作。

8、基因芯片是一种先进的、大规模、高通量检测技术，在疾病诊断上具有高度的灵敏性和准确性,快速简便,可同时检测多种疾病。杨鸣发等(2021)研发了基于pprv n基因的芯片式数字pcr(cdpcr)，其检测结果的灵敏度能达到rt-qpcr的100倍。朱晓光等(2010)也研制了可以检测麻疹病毒属6种病毒的基因芯片，灵敏度为1×10-2tcid50/100μl，并在此基础上采用生物素化引物实现了可视化基因芯片检测，灵敏度较普通基因芯片提高了10倍。基因芯片技术虽然具有高特异性、高准确性的优点，但高成本和需要专门仪器设备的缺陷限制了其应用范围。

9、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，lamp)为等温核酸扩增技术。目前已建立的pprv n基因lamp检测方法的敏感性和特异性与rt-qpcr相当，可同时检测不同谱系的毒株，且通过添加不同染料或比浊法的方式，实现了检测结果的可视化判断。靶向f、m基因的可视化rt-lamp方法也成功被建立。rt-lamp也朝多病原检测方向发展，范晴等通过靶向pprv的n基因和btv的ns3基因，建立了可视化多重荧光rt-lamp方法，降低了检测成本且增加了方便性，但反应时间延长至115min以上，降低了检测速度，且结果观察需要不同波长的光源照射。

10、重组酶聚合酶扩增技术(rpa)也是一种等温核酸扩增技术，目前已建立多种pprv的rpa检测方法。李园丽建立了以p基因为检测对象的pprv实时rt-rpa，检测最低限为14.98拷贝数或0.326tcid50/ml。yang et al开发了检测pprv n基因的rt-rpa和横向流动试纸条结合的检测方法(lfs rt-rpa)，可在20min内完成检测。与lamp方法相比，rpa具有特异性高、灵敏度强、操作简单、反应时间短等优点，是一种新的更为适宜现场诊断的方法。

11、随着新型检测技术的发展和进步，ppr检测方法应结合新兴技术手段向低成本、可视化、简易化、高通量、高效率、高特异性(可区分谱系，区分混合感染)中的几个或多个方向发展。rt-lamp恒温核酸扩增方法目前虽处于研究阶段，但具有实现可视化和进一步提高检测效率的突出优点，非常有必要持续开展研究和深度优化并最终实现临床应用。

12、ppr自1942年首次暴发至今，国内外关于ppr发生和流行的报道持续不断，传播范围不断扩大，感染宿主种类也不断地增多，严重制约羊养殖畜牧业发展，为woah全球根除计划的实施造成极大困难，其中快速检测方法是及时发现并控制ppr扩散的有效手段，也是根除该病的重要手段之一。目前虽然建立了多种ppr核酸和抗体检测方法，如r t-pcr、rt-qpcr、基因芯片数字pcr、核酸探针、celisa、化学发光等，但这些方法要么需要精密仪器、成本较高，要么检测时间较长、结果判定方式较为繁琐，限制了其在临床诊断中的推广应用。本发明通过pprv m基因设计特异性引物并优化温度、镁离子浓度、dntp浓度、引物浓度、染料等重要参数，建立一种原理简单、操作简便且结果简单明显的可视化核酸检测方法，样品检测效果较rt-pcr、elisa等方法更为便携，可为技术与设备匮乏的地区及现场快速诊断提供技术保障。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供小反刍兽疫病毒的可视化rt-lamp检测引物组，包括如下三个引物对：

2、外引物：

3、pprv-f3：5’-accgagatctacgacttcga-3’；

4、pprv-b3:5’-agagccaaaggttcttccg-3’；

5、内引物：

6、pprv-fip：5’-tcagtcggccgtcgtggtag-gcatgggatgtcaaagggt-3’；

7、pprv-bip：5’-cgatcctggtctgggagacaga-agggggtcgttatcctcaa-3’；

8、环引物：

9、pprv-lf：5’-tgggttctatgcgggcaatt-3’；

10、pprv-lb：5’-gagtgctttatgtacctgtttctcc-3’。

11、一种小反刍兽疫病毒的可视化rt-lamp检测方法，采用上述的可视化rt-lamp检测引物组进行rt-lamp反应。

12、优选地，反应温度为65℃，镁离子mg2+浓度为6～8μmol/l，dntp浓度为1.0μmo l/l。

13、优选地，外引物f3/b3浓度为0.1～0.15μmol/l，内引物浓度为1.0～1.4μmol/l，环引物浓度为1.2～1.3μmol/l。

14、优选地，采用中性红作为染料，中性红染料的浓度200μmol/l。

15、小反刍兽疫病毒的可视化rt-lamp检测方法在制备小反刍兽疫新型检测制剂中的应用。

16、本发明基于pprv m基因建立了一种可视化环介导等温扩增(rt-lamp)检测方法。通过ncbi数据库选取和比对pprv n和m基因序列，设计并筛选特异性引物，经温度、镁离子、dntp、引物浓度等试验条件优化，建立了以中性红染料为显示剂、以病毒n或m基因为检测对象的pprv可视化rt-lamp检测方法。可视化rt-lamp的检测最低限度为1.5×102copies，其灵敏度比rt-pcr高1000倍，特异性与rt-qpcr相当；临床样品检测表明，建立的可视化rt-lamp方法可在45min内完成检测，与商品化直接rt-q pcr试剂盒检测结果一致，但较rt-pcr和rt-qpcr用时短且操作简单。

17、本发明提供了稳定、快速、简单快捷的可视化rt-lamp检测方法，其较rt-pcr、elisa等方法更为便携和快速，可解决技术与设备匮乏地区及现场快速的检测难题，为小反刍兽疫新型检测制剂的创制提供了新思路和新方法。