抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用

本发明属于生物，涉及抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段及其相关生物材料与应用。

背景技术：

1、鼠疫是由鼠疫耶尔森氏菌(yersinia pestis，简称鼠疫菌/鼠疫杆菌)感染引起的一种人畜共患传染病，其传染性强，病程进展块，病死率极高。

2、目前对鼠疫的临床治疗主要采用抗生素，但抗生素的使用易产生耐药株，目前已分离出鼠疫耶尔森菌的多重耐药菌株，因此研究新的治疗手段就显得尤为重要。目前，还没有获得批准供人类使用的鼠疫疫苗。当前的候选亚单位疫苗由两种保护性抗原f1和lcrv配制而成。两种抗原都会引发中和抗体反应，这些中和抗体可直接作用于细菌，从而使宿主清除感染。因此特异性的鼠疫中和抗体用于鼠疫治疗是未来的一个重要发展方向。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供有保护效果的抗鼠疫耶尔森氏菌的抗体。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明的目的是提供一株鼠疫中和抗体及其应用。

4、第一方面，本发明要求保护抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段。

5、本发明要求保护抗鼠疫耶尔森氏菌的重链抗体或其抗原结合片段，所述重链抗体或其抗原结合片段含有名称为hcdr1、hcdr2和hcdr3的三个互补决定区，所述hcdr1、hcdr2和hcdr3的氨基酸序列分别为是seq id no.1的第26-33位、seq id no.1的第51-58位、seqid no.1的第97-110位。

6、上述互补决定区的序列根据kabat定义。

7、进一步地，所述重链抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列为seq id no.1，或者与seq id no.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。

8、在本发明保护范围内，所述抗体可为全长抗体、单链fv片段、fab片段、f(ab’)2片段等各种形式。

9、在本发明的具体实施方式中，所述全长抗体的重链恒定区为igg1亚型。

10、具体地，所述重链抗体为fw3-r1-fc、fw3-r3-fc和fw3-fc，所述fw3-r1-fc的氨基酸序列为seq id no.10，所述fw3-r3-fc的氨基酸序列为seq id no.12，所述fw3-fc的氨基酸序列为seq id no.4，或者与seq id no.10、seq id no.12或seq id no.4具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。

11、具体地，所述抗原结合片段为单域抗体。所述单域抗体的氨基酸序列可为seqidno.1。

12、上述术语“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体(parental antibody)的抗原结合区或可变区(例如一个或多个cdr)。所述抗原结合片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。通常，当基于摩尔来表示活性时，所述抗原结合片段保留至少10％的母体结合活性。具体地，所述抗原结合片段保留至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更多的母体抗体对靶标的结合亲和力。

13、第二方面，本发明要求保护生物材料，所述生物材料为如下任一种：

14、1)含有前述的重链抗体或其抗原结合片段的单克隆抗体；

15、2)含有前述的重链抗体或其抗原结合片段的小分子抗体。

16、所述小分子抗体可为如下任一种：

17、f1、fab抗体；

18、f2、fv抗体；

19、f3、单链抗体；

20、f4、fab′片段。

21、术语“fab′片段”含有一条抗体轻链和包含vh结构域和ch1结构域以及ch1和ch2结构域之间区域的一条抗体重链的部分，由此可在两个fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成f(ab′)2分子。

22、术语“f(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含ch1和ch2结构域之间的恒定区的部分的重链，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，f(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个fab′片段组成。

23、术语“纳米抗体(单域抗体)”(vhh)为由抗体重链可变区组成的多肽。单域抗体可按照如下方法制备：将抗体重链可变区(vh)通过基因工程方法表达，获得仅含vh片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。

24、术语“最小识别单位(mru)”是指仅含可变区中单一cdr结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

25、术语“fab抗体”是由抗体的重链fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。可按照如下方法制备fab抗体：将重链fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达fab抗体(fab片段)，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链fd指fab中约1/2的h链部分(约含225个氨基酸残基，包括vh、ch1和部分铰链区)。

26、术语“fv抗体”是仅由抗体的重链可变区和轻链可变区组成的化合物。重链可变区和轻链可变区通过非共价键连接。可按照如下方法制备fv抗体：可分别构建含有vh和vl基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性fv抗体；也可在载体中的vh和vl之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成fv抗体(fv片段)。

27、术语“单链抗体”(scfv)是用短肽将抗体的重链可变区和轻链可变区连接而成的多肽。可按照如下方法制备scfv：是指用寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(scfv)。多肽链能自发折叠成天然构象，保持fv的特异性和亲和力。

28、第三方面，本发明要求保护一种核酸分子，所述核酸分子编码前述的重链抗体或其抗原结合片段。

29、进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链可变区中hcdr1、hcdr2和hcdr3的核苷酸序列分别为seq id no.2自5’端起第76-99位、第151-174位、第289-330位。

30、更进一步地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的所述重链可变区的核苷酸序列为seq id no.2或者与seq id no.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。

31、更加具体地，在所述核酸分子中，编码所述抗体的重链的核苷酸序列为seqidno.3或者与seq id no.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上、80％以上或者75％以上的一致性(不一致处优选在骨架区(fr))。

32、第四方面，本发明要求保护含有前文第三方面所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。

33、在本发明的具体实施方式中，将seq id no.3(抗体重链的编码基因)克隆到ptse-hfc载体的酶切位点sal i和nhel i之间后得到表达所述抗体的重链的重组表达载体；所述重组细胞为将上述分别表达所述抗体重链重组表达载体转染hek293-f细胞后得到的重组细胞。

34、第五方面，本发明要求保护一种药物组合物。

35、本发明所要求保护的药物组合物包含前文第一方面中所述的抗体和生理上或药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

36、本文中，上述“生理上或药学上可接受的载体或稀释剂”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害药物组合物中所述试剂的生物活性及性能的那些载体和稀释剂。

37、本文中，“生理上或药学上可接受的赋形剂”是指加到药物组合物中进一步有利于所述试剂的服用的惰性物质。这里的载体材料包括但不限于水溶性载体材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有机酸等)、难溶性载体材料(如乙基纤维素、胆固醇硬脂酸酯等)、肠溶性载体材料(如醋酸纤维素酞酸酯和羧甲乙纤维素等)。其中优选的是水溶性载体材料。

38、第六方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

39、(a1)前文第三方面中所述的核酸分子或表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌在制备前文第一方面中所述抗体或前文第五方面中所述药物组合物中的应用；

40、(a2)前文第一方面中所述抗体在制备前文第四方面中所述药物组合物中的应用；

41、(a3)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于预防和/或治疗由鼠疫耶尔森氏菌感染所致疾病的产品中的应用；

42、(a4)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于抑制鼠疫耶尔森氏菌感染的产品中的应用；

43、(a5)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

44、(a6)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于中和鼠疫耶尔森氏菌的产品中的应用；

45、(a7)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于检测鼠疫耶尔森氏菌的f1蛋白的产品中的应用；

46、(a8)前文第一方面中所述抗体或前文第三方面中所述核酸分子或前文第四方面中所述表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌或前文第五方面中药物组合物在制备用于结合鼠疫耶尔森氏菌的f1蛋白的产品中的应用。

47、在本发明的具体实施方式中，所述鼠疫耶尔森氏菌具体为鼠疫耶尔森氏菌201株。

48、本发明制备了一种抗鼠疫菌的中和抗体。实验证明，该抗体能够特异性结合鼠疫菌保护性抗原f1蛋白，能够中和鼠疫菌，可完全保护小鼠免受50倍ld50鼠疫菌肺递送攻击。本发明所提供的抗体可用于鼠疫菌感染的防治，具有重要的生物学和医学意义。