一种LMTIA技术鉴别当归的引物组、检测方法、试剂盒及其应用

本发明涉及分子生物学核酸检测，特别是涉及一种lmtia技术鉴别当归的引物组、检测方法、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、dna具有较高的遗传稳定性，不同的生物含有不同的特异性dna，基于dna的检测方法已经成为食品或药品真实性鉴别中物种源性成分鉴定最主要也是最有效的技术。

2、中药是中华民族的传统瑰宝，中医和中药也是中华民族传统文化的重要组成部分。中药使用应在中医理论指导下进行。根据《中华人民共和国药典(2020年版)》记载，中药当归为伞形科植物当归(angelica sinensis(oliv.)diels)的干燥根，而日本厚生劳动省规定东当归(japanese angelica root)是伞形科植物angelica acutiloba(sieb.etzucc.)kitagawa的干燥根，主干粗短，分枝根多，近梭形。当归具有治疗女性月经不调、抑制平滑肌炎症、调节血压、对急性肝损伤有治疗作用，对动脉粥样硬化有保护作用。从当归中分离得到多糖类、酚酸类和当归内酯类等多种生物活性成分，当归多糖可改善肿瘤微环境并增强免疫功能。由于各国对当归品种的定义存在差异，严重影响用药安全。因此，需要一种行之有效的鉴别方法来对其进行区分。

3、目前，对当归的鉴别方法有：液相色谱测定当归中酚酸类物质阿魏酸的含量来对当归进行鉴别；通过原始近红外光谱对不同产地的当归药材进行鉴别；通过dna条形码技术进行鉴别；通过pcr方法对不同种当归进行鉴别。但色谱技术所用设备昂贵，对操作人员的专业技术要求高；近红外光谱需要与其他方法联合，光谱数据量大，不易实现快速检测。dna技术不受发育阶段、环境因素、栽培区域等条件的影响，有利于药材的鉴别。lmtia是一种基于梯形熔解曲线的等温扩增技术，其建立在引物和靶序列的解链温度(tm)之间的差异上。与传统pcr相比，lmtia方法具有：不需要热循环仪；适合于较短的靶序列，最短可达到60bp；反应速度快，20min内可完成扩增反应；灵敏度高，与lamp技术相比灵敏度高50倍；所用的bst酶具有逆转录酶活性适用性广，可用于检测dna或rna。lmtia技术已成功应用于红薯淀粉木薯成分检测；食用油、乳制品中大豆源成分检测；食品中单核细胞增生李斯特氏菌污染检测；以及牛肉中鸡肉、猪肉源成分检测；人参与西洋参鉴别等多个领域。目前还未见利用lmtia技术鉴别当归相关的报道。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种lmtia技术鉴别当归的引物组、检测方法、试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过设计检测当归的特异性引物和探针，基于lmtia技术建立了鉴别当归成分的方法，该方法能快速、高效、准确的鉴定出食品或药品中当归成分，为食品或药品的真实性鉴定提供技术手段。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种lmtia技术鉴别当归的引物组，所述引物组包括如下所示引物和探针：

4、dangg-f(seq id no:1)：5’-accagtacagctttttctgggtgtcacgcatcatct-3’；

5、dangg-b(seq id no:2)：5’-gtactggtatggttttgccaaccgcacaacaagg-3’；

6、dangg-lf(seq id no:3)：5’-ccacgaggagtgagtgg-3’；

7、dangg-lb(seq id no:4)：5’-gggcggaaattggcc-3’；

8、dangg-lfpr(seq id no:5)：5’-6-fam-caggagtgagtgg-bhq1-3’。

9、本发明还提供了一种用于鉴别当归的试剂盒，包括所述的引物组。

10、本发明还提供了所述的引物组或所述的试剂盒在检测食品或药品中当归成分中的应用。

11、本发明还提供了一种鉴别当归的方法，包括以下步骤：

12、以待测样品dna为模板，利用所述的引物组进行实时荧光pcr扩增，根据扩张曲线的有无判断所述待测样品中是否含有当归。

13、优选的是，所述判断的方法为：若扩增结果中出现指数扩增曲线，则所述待测样品中含有当归成分；若扩增结果中没有出现扩增曲线，则所述待测样品中不含有当归成分。

14、优选的是，所述实时荧光pcr扩增的反应体系包括：引物dangg-f、dangg-b、dangg-lf和dangg-lb共0.4μl，探针dangg-lfpr 0.1μl，反应预混液5μl，dna聚合酶0.4μl，depc水2.1μl和模板dna 2μl。

15、优选的是，所述引物dangg-f、dangg-b、dangg-lf和dangg-lb和探针dangg-lfpr的摩尔比为8∶8∶2∶2∶5。

16、优选的是，所述实时荧光pcr扩增的程序为：61℃等温扩增20min。

17、本发明公开了以下技术效果：

18、本发明设计了检测当归的特异性引物和探针，基于lmtia技术建立了快速鉴别当归的方法，该方法在恒温条件下即可实现对样品中当归成分的快速检测，灵敏度高，特异性强，最低检测限为10pg/μl。本发明为当归真实性鉴别提供了一种新的方法，为食品或药品中当归的真实性鉴定提供技术手段。

技术特征：

1.一种lmtia技术鉴别当归的引物组，其特征在于，所述引物组包括如下所示引物和探针：

2.一种用于鉴别当归的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

3.如权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒在检测食品或药品中当归成分中的应用。

4.一种鉴别当归的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述判断的方法为：若扩增结果中出现指数扩增曲线，则所述待测样品中含有当归成分；若扩增结果中没有出现扩增曲线，则所述待测样品中不含有当归成分。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光pcr扩增的反应体系包括：引物dangg-f、dangg-b、dangg-lf和dangg-lb共0.4μl，探针dangg-lfpr 0.1μl，反应预混液5μl，dna聚合酶0.4μl，depc水2.1μl和模板dna 2μl。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述引物dangg-f、dangg-b、dangg-lf和dangg-lb和探针dangg-lfpr的摩尔比为8∶8∶2∶2∶5。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光pcr扩增的程序为：61℃等温扩增20min。

技术总结
本发明公开了一种鉴别当归的LMTIA引物组、试剂盒、检测方法及应用，属于分子生物学核酸检测技术领域。本发明设计了鉴别当归的LMTIA引物组包括引物DangG‑F、DangG‑B、DangG‑LF、DangG‑LB和探针DangG‑LFPr，基于LMTIA技术构建了鉴别当归的方法，该方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强的优势。利用该方法能快速、高效、准确的鉴定出食品或药品中当归成分，本发明为食品或药品中当归的真实性鉴定提供技术手段。

技术研发人员：肖付刚,张尧轩,郑尧天,席潇琪,王德国,孙军涛,崔鹏飞,刘金鑫,胡博淳,张良,刘艳群,尹百灵,倪俊娟
受保护的技术使用者：许昌学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12