基于杂交链式反应（HCR）的鱼类病原微生物嗜水气单胞菌16SrRNA基因检测试剂盒及其应用

本发明涉及一种鱼类病原微生物的测定或检验所用的组合物及其检测方法，尤其涉及一种基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌16srrna基因的检测试剂盒的开发及其应用。

背景技术：

1、嗜水气单胞菌 ( aeromonas hydrophila)属弧菌科气单胞菌属，为革兰阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽孢和荚膜，是一种条件致病菌，在自然界尤其水中广泛分布。该菌可产生多种毒力因子，为鱼类流行性败血症的主要病原菌，感染后常引发暴发性出血病，导致鱼类大面积死亡，在患病鱼的肠道、鳃、肝等器官均可分离并检测到嗜水气单胞菌。嗜水气单胞菌感染宿主种类广，包括鱼类、甲壳类、两栖类等多种动物类群，在中国常见感染宿主为鲤科鱼类。嗜水气单胞菌感染导致多种鱼类流行病频发，造成严重的经济损失，制约了水产鱼类养殖业的健康发展。

2、为了减少或防止这种病害，一般要对易发病动物进行嗜水气单胞菌的检测，以便对已感染病菌的动物进行隔离和治疗，或者可以通过检测确定病因及时对症下药。

3、目前对嗜水气单胞菌的检测以常规生物学检测方法为主，有基于体外扩增pcr方法来对鱼类致病菌嗜水气单胞菌进行检测，例如：

4、cn1506468a嗜水气单胞菌的pcr检测试剂盒及其检测方法

5、cn101736073a一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重pcr快速检测试剂盒和检测方法

6、cn101736073b一种气单胞菌和嗜水气单胞菌双重pcr快速检测试剂盒和检测方法

7、cn102134597a fq-pcr检测嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的试剂盒

8、cn102925578b一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法

9、cn102925578a一种气单胞菌属细菌的检测试剂盒和检测方法

10、cn109929938a检测气单胞菌的特异性引物对、试剂盒、应用、pcr检测方法

11、另有少数专利与其他的分子生物技术息息相关，如:

12、cn114807395a-一种基于raa_crispr系统的新型双重致病性嗜水气单胞菌检测方法及应用

13、cn114540513a一种rpa_lfs快速检测嗜水气单胞菌的引物和探针组合物及方法

14、cn112852978b一种黄河鲤抗嗜水气单胞菌感染相关的snp分子标记及其应用

15、除此之外，还有利用嗜水气单胞菌含有的特异性基因 aer来对其进行测定的检测方法，如：

16、cn111235287b基于lamp法检测含 aer基因的气单胞菌的引物组及其应用

17、cn109929938a检测气单胞菌的特异性引物对、试剂盒、应用、pcr检测方法

18、以往的检测方法往往存在如下缺点: 检测过程较多的出现假阳性、假阴性情况；生化检测操作过程复杂，检测周期长，通常需要二至三天才能检测完一次待测样品；生化检测通常需要将待测菌株经较长时间的培养才能进行检测；生化检测需要较高的技术和设备条件，检测成本高。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌检测的试剂盒及其应用。

2、本发明采用的技术方案：基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌16srrna基因的检测试剂盒，包括根据目标鱼类病原微生物嗜水气单胞菌特异性dna序列16s ribosomal rna设计的16srrna-h1及16srrna -h2一对发夹引物、荧光基团、猝灭基团、dna储存液（1x）、cacl2溶液，所述目标鱼类病原微生物嗜水气单胞菌测定的特异性dna序列16srrna为：

3、agagtttgatcctggctcagattgaacgctggcggcaggcctaacacatgcaagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggaaattgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattggatatgcccaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggttgatgcctaatacgtatcaactgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggttggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctgcagagatgcgggagtgccttcgggaatcagaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgtcctttgttgccagcacgtaatggtgggaactcaagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcgtacagagggctgcaagctagcgatagtgagcgaatcccaaaaagcgcgtcgtagtccggatcggagtctgcaactcgactccgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagatagcttaaccttcgggagggcgtttaccacggtgtgattcatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaaccctaggggaacctggggctggatcaccctcctttcta

4、所述引物16srrna -h1序列为：

5、ttgatacgtattaggcatcaacctttcccaatacacaaaggttgatgcctaa；

6、所述引物16srrna -h2序列为：

7、aaaggttgatgcctaatacgtatcaattaggcatcaacctttgtgtattggg。

8、所述引物16srrna-h1序列的5’和3’端分别用荧光基团fam、荧光猝灭基团bhq修饰。

9、所述的基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌检测试剂盒，包括如下试剂：0.1m cacl2溶液30ml；dna储存液（1x）50 μl；100μm 16srrna -h1引物20 μl；100μm 16srrna -h2引物20 μl；ddh2o 500 μl。0.1m cacl2溶液（1.11g cacl2，定容至100ml）;dna储存液（1x）（2.423g tris，0.7445g edta•2h20，2.5413g mgcl2,定容至1000ml）。

10、所述的基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌的检测试剂盒在各种水体环境及鱼组织样中检测鱼类病原微生物嗜水气单胞菌的应用。

11、检测方法包括以下步骤：

12、s1 提取待测样本：取水体样本或取患病鱼类脏器组织小块;

13、s2 分离样品中所含菌体，制备菌体悬液；

14、s3向菌体悬液中加入h1与h2引物各1μl;

15、s4 先于冰上静置20min;

16、s5 再置于42℃恒温条件下热激90 s，热激完成后迅速置于冰上冷却3-5min；

17、s6 加入dna储存液1μl和6μl ddh2o后室温放置4-6 h，使用荧光显微镜进行检测。

18、6、根据权利要求 5 所述的应用，其特征在于，菌体悬液的制备包括步骤:

19、s7 吸取待测养殖水体水样或从患病动物脏器组织样本中分离病原菌;

20、s8 置于5 ml lb液体培养基中摇2-3h（参数为：200rmp,37℃）;

21、s9 将培养后的菌液倒入1.5ml ep管中，4000rmp离心5min,去掉上清。重复操作，直至菌液收集完成;

22、s10 取1 ml 0.1 m cacl2于ep管中，悬浮菌体，室温静置10 min;

23、s11 离心后去上清（参数为：4000rmp,5min）；

24、s12 加入3μl 0.1m cacl2混匀，作为原始浓度细胞感受态悬液。

25、所述嗜水气单胞菌应在使用荧光显微镜观察时于100x油镜下呈现绿色荧光。

26、与现有技术相比，本发明的优点在于：

27、本发明提供了一种基于杂交链式反应（hcr）鱼类病原微生物嗜水气单胞菌检测的试剂盒，该试剂盒对于鱼类致病菌-嗜水气单胞菌可以达到准确、快速的检测效果。hcr反应是一个简单而有效的等温扩增过程，无需酶介导。基于hcr反应对水体中鱼类致病微生物进行检测大大提高了病原菌检测的灵敏度。操作简单易学，检测周期短，检测成本较低，基本不会由于操作者的个人因素导致结果的误差。