靶向BCMA的单域抗体、CAR细胞及其用途的制作方法

本发明属于细胞免疫治疗，具体涉及靶向bcma的单域抗体、car细胞及其用途。

背景技术：

1、多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)是一种单克隆浆细胞异常增殖的恶性疾病，其特征为骨髓浆细胞异常增生，分泌单克隆免疫球蛋白或其片段(m蛋白)，是血液系统常见的恶性肿瘤。多发性骨髓瘤(mm)常见症状包括骨髓瘤相关器官功能损伤以及继发淀粉样变性等相关表现，过度分泌的免疫球蛋白以及不受控制的浆细胞引起患者的终末器官的损伤，最终导致患者的死亡。临床上mm的常规治疗手段是蛋白酶体抑制剂、免疫抑制剂和anti-cd38单抗，但是往往表现出不良的临床结果，缓解率和生存率都很低。中国多发性骨髓瘤诊治指南(2022年修订)推荐经全身体能状态评分良好的多发性骨髓瘤患者，首选自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，asct)，对于年轻的具有高危预后因素且有合适供者的患者，可考虑异基因造血干细胞移植(allo-sct)。

2、目前以bcma(b-cell maturation antigen，b细胞成熟抗原)为靶点的car-t疗法已被证明在多发性骨髓瘤中具有临床有效性。bcma(cd269，tnfrsf17)是一种iii型跨膜糖蛋白，属于人类肿瘤坏死因子受体(tnfr)超家族，在b细胞成熟和分化为浆细胞中起主要作用。baff和april是与bcma结合的两种b细胞激活和扩增诱导配体，共同调控b细胞功能。研究表明，bcma普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系，在多发性骨髓瘤患者中的检测也得到了一致性的结果。carpenter等在已有报道的基础上，又联合应用q-pcr、flow cytometry和免疫组化方法深入研究了bcma的表达特征，确认bcma在成熟b细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在cd34+造血细胞中也无表达。因此bcma成为多发性骨髓瘤和其他血液系统恶性肿瘤的免疫治疗策略的热门靶点。bb2121(abecma)为首款获得监管批准的bcma car-t细胞疗法。在美国和欧盟，abecma分别被授予了突破性药物资格(btd)和优先药物资格(prime)。在关键ii期karmma研究试验中，接受abecma单次输注治疗后，有73％患者获得了持久有效的缓解，33％的患者达到了严格的完全缓解。同时abecma在接受治疗的患者中安全性已得到很好的证实，细胞因子释放综合征(crs)和神经毒性(nt)大多数为低级，并能快速消退。

3、car-t(chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy)即嵌合抗原受体t细胞免疫疗法。嵌合抗原受体技术是采用基因工程技术修饰免疫细胞，使其表达外源性抗肿瘤基因(car基因)，使得淋巴细胞等免疫细胞具有识别肿瘤细胞表面抗原的能力，并特异性识别和杀伤肿瘤细胞，没有组织相容复合体(mhc)的限制。嵌合抗原受体(car)的结构主要由细胞外识别肿瘤细胞表面抗原的结构域和细胞内信号转导结构域组成，细胞外的结构域用于特异性地识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)，细胞内的结构域含有共刺激分子结构域，用于在识别肿瘤表面特异性蛋白(抗原)后启动淋巴细胞的免疫应答，针对特异性的靶细胞发挥细胞毒性的作用，从而杀伤肿瘤靶细胞。尽管以bcma为靶点的car-t细胞治疗对多发性骨髓瘤表现出持久的缓解率，但是治疗后经常复发和出现耐药性。另外，car-t细胞在体内的增殖能力较差，对肿瘤细胞的杀伤效率较低也会客观上加大car-t细胞的使用剂量，容易造成较强的毒副作用，如炎症因子风暴和中枢神经系统毒性。因此，仍然迫切需要对靶向bcma的car-t细胞进行设计改造，寻找对bcma亲和力好的抗体等，进一步提高靶向bcma的car-t细胞疗法的疗效及其安全性和有效性。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种靶向bcma的单域抗体、含有该单域抗体的嵌合抗原受体、利用其制备的car-t细胞及其用途。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

2、为了实现上述目的，本发明首先提供了特异性靶向bcma的单域抗体，所述单域抗体包含氨基酸序列分别是seq id no.1的第47-54位的互补决定区cdr1、seq id no.1的第72-78位的互补决定区cdr2和seq id no.1的第117-129位的互补决定区cdr3。

3、进一步地，所述单域抗体的氨基酸序列可为下述任一种：

4、a1)seq id no.1的第22-140位；

5、a2)与a1)所示氨基酸序列具有至少80％的同一性且具有相同的功能的氨基酸序列。

6、本发明还提供了嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，car)，所述嵌合抗原受体包括所述单域抗体。

7、所述单域抗体为所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域。

8、进一步地，所述嵌合抗原受体还可包括cd8a铰链区、cd8a跨膜区和胞内信号区，所述胞内信号区可包括共刺激结构域4-1bb和激活结构域cd3ζ。

9、进一步地，所述cd8a铰链区的氨基酸序列可为seq id no.1的第141-185位。

10、进一步地，所述cd8a跨膜区的氨基酸序列可为seq id no.1的第186-209位。

11、进一步地，所述4-1bb的氨基酸序列可为seq id no.1的第210-256位。

12、进一步地，所述cd3ζ的氨基酸序列可为seq id no.1的第257-368位。

13、进一步地，所述嵌合抗原受体可为下述任一种：

14、b1)氨基酸序列是seq id no.1的第22-368位所示的蛋白质；

15、b2)在b1)的n端和/或c端连接标签或信号肽得到的与b1)具有相同功能的融合蛋白质。

16、进一步地，b2)中所述信号肽的氨基酸序列可为seq id no.1的第1-21位。

17、本文所述嵌合抗原受体自n-末端至c-末端依次可包含所述信号肽、所述单域抗体、所述cd8a铰链区、所述cd8a跨膜区、所述共刺激结构域4-1bb和所述激活结构域cd3ζ。

18、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

19、本文中，所述至少80％的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

20、本文所述标签包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、his标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、gfp(绿色荧光蛋白)、cfp(青色荧光蛋白)、yfp(黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。

21、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的、具有与本发明所述嵌合抗原受体的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述嵌合抗原受体且具有所述嵌合抗原受体的等同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

22、本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述任一种：

23、c1)编码所述单域抗体的核酸分子；

24、c2)编码本文中任一所述嵌合抗原受体的核酸分子；

25、c3)含有c1)或c2)所述核酸分子的表达盒；

26、c4)含有c1)或c2)所述核酸分子的重组载体、或含有c3)所述表达盒的重组载体；

27、c5)含有c1)或c2)所述核酸分子的重组微生物、或含有c3)所述表达盒的重组微生物、或含有c4)所述重组载体的重组微生物；

28、c6)含有c1)或c2)所述核酸分子的重组细胞、或含有c3)所述表达盒的重组细胞、或含有c4)所述重组载体的重组细胞。

29、其中，c3)所述的表达盒、c4)所述的重组载体、c5)所述的重组微生物和c6)所述的重组细胞均可表达本文所述的嵌合抗原受体。

30、上述生物材料中，c1)所述核酸分子可为下述任一种：

31、e1)核苷酸序列或编码序列是seq id no.2的第64-420位所示的dna分子；

32、e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子。

33、上述生物材料中，c2)所述核酸分子可为下述任一种：

34、f1)核苷酸序列或编码序列是seq id no.2的第64-1104位或seq id no.2所示的dna分子；

35、f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的dna分子。

36、seq id no.2的第64-420位所示的dna分子编码氨基酸序列为seq id no.1的第22-140位的单域抗体。

37、seq id no.2所示的dna分子编码氨基酸序列为seq id no.1所示的嵌合抗原受体bcma-vhh-130car。

38、本发明还提供了修饰的免疫效应细胞，所述修饰的免疫效应细胞可表达本文中任一所述的嵌合抗原受体。

39、进一步地，所述修饰的免疫效应细胞可含有编码本文中任一所述嵌合抗原受体的核酸分子。

40、进一步地，所述免疫效应细胞可包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、γδt细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞和多能干细胞。

41、进一步地，所述免疫效应细胞可包括自体或非自体的免疫效应细胞。

42、进一步地，所述修饰的免疫效应细胞可包括car-t细胞、car-nk细胞、car-nkt细胞、car-γδt细胞、car-巨噬细胞(car-m细胞)、car-ipsc细胞和car-psc细胞。

43、具体地，本发明还提供了car-t细胞，所述car-t细胞可表达本文中任一所述的嵌合抗原受体。

44、进一步地，所述car-t细胞可为本文中任一所述的嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞(t细胞)，其靶向bcma(b细胞成熟抗原，b-cell maturation antigen，cd269，tnfrsf17)。

45、在本发明的一个或多个实施方案中，所述car-t细胞含有和/或表达seq id no.2的第64-1104位或seq id no.2所示的嵌合抗原受体基因。

46、本文所述car-t细胞可具有下述至少一种特性：

47、g1)分泌t细胞特异性效应分子ifn-γ；

48、g2)特异性杀伤bcma阳性肿瘤细胞；

49、g3)抑制bcma阳性肿瘤细胞增殖。

50、本发明还提供了所述单域抗体、本文中任一所述的嵌合抗原受体、所述生物材料或所述修饰的免疫效应细胞(如car-t细胞等)在制备具有如下任一种功能的产品中的应用：

51、d1)预防或治疗肿瘤(如bcma阳性的肿瘤)；

52、d2)预防或治疗bcma靶点相关疾病；

53、d3)杀伤bcma阳性的肿瘤细胞；

54、d4)抑制bcma阳性的肿瘤细胞增殖；

55、d5)检测表达bcma的癌细胞。

56、本文中，所述bcma阳性的肿瘤或bcma靶点相关疾病可包括多发性骨髓瘤(multiple myeloma，mm)、慢性髓细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia，cml)、b细胞急性淋巴细胞白血病(acute b-lymphoblastic leukemia，all)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma，nhl)和霍奇金淋巴瘤(hodgkin lymphoma)但不限于此。

57、本发明还提供了一种修饰的免疫效应细胞(如car-t细胞)的制备方法，所述制备方法可包括：将本文中任一所述的嵌合抗原受体的编码基因转入免疫效应细胞(如t细胞)中表达，得到所述修饰的免疫效应细胞(如car-t细胞)。

58、进一步地，所述方法可包括如下步骤：

59、(1)将bcma-vhh-130car基因(seq id no.2)构建到逆转录病毒载体(如mp71)中，得到重组逆转录病毒载体；

60、(2)将所述重组逆转录病毒载体导入包装细胞进行包装，得到重组逆转录病毒；

61、(3)将所述重组逆转录病毒感染免疫效应细胞(如人的t细胞)，得到重组细胞。

62、进一步地，所述包装细胞可为phoenix ecotropic(eco)细胞和pg13细胞。

63、本文所述单域抗体序列具有改善的亲和力和/或效价的其他变体可通过采用在本领域已知的方法来获得，并包括在本发明的保护范围内。例如，氨基酸置换可用于获得具有进一步改善的亲合力的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化也可用来改善用于产生抗体的表达系统中的翻译效率。此外，包含通过对本发明的任何核酸序列应用定向进化法而优化抗体特异性的序列的多核苷酸也属于本发明的范围内。

64、在某些实施方案中，可以在本发明所述单域抗体的一个或多个互补决定区或框架区内发生替代、插入或删除，只要此类变化不实质性降低抗体结合抗原的能力。例如，可以对互补决定区和/或框架区做出保守变化(例如，保守替代，本领域技术人员所熟知，氨基酸的保守性取代不改变蛋白质的性质和功能)，其不实质性降低结合亲和力。例如，此类变化可以在互补决定区中的抗原接触残基以外。

65、本发明还提供了所述单域抗体、本文中任一所述嵌合抗原受体或所述生物材料在制备修饰的免疫效应细胞中的应用。

66、上述应用中，所述免疫效应细胞可包括t细胞、nk细胞、nkt细胞、γδt细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞和多能干细胞。

67、本发明还提供了药物组合物，所述药物组合物可含有所述单域抗体、本文中任一所述的嵌合抗原受体或所述修饰的免疫效应细胞。

68、所述药物组合物可用于预防或治疗bcma靶点相关疾病。

69、进一步地，所述药物组合物还可包括一种或者多种药学上可接受的载体。

70、进一步地，所述药学上可接受的载体可为赋形剂、稳定剂、悬浮剂或稀释剂等，是本领域的技术人员所周知的。

71、本发明还提供了试剂盒，所述试剂盒可含有所述单域抗体、本文中任一所述的嵌合抗原受体或所述修饰的免疫效应细胞。

72、所述试剂盒可用于检测表达bcma的癌细胞，或用于检测bcma阳性癌症是否存在于受试者中。

73、本发明还提供了预防或治疗bcma靶点相关疾病的方法，所述方法可包括向患有bcma靶点相关疾病的受试者施用所述修饰的免疫效应细胞或所述药物组合物。

74、上述方法中，所述bcma靶点相关疾病可为bcma阳性癌症。

75、本文所述bcma阳性癌症可包括多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、b细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤。

76、本文所述产品可包括试剂、试剂盒、药物或药物组合物。

77、本发明设计了具有新颖结构的靶向bcma的car-t细胞(bcma-vhh car-t细胞)，实验证明，本发明的bcma-vhh car-t细胞能够很好地分泌t细胞特异性效应分子ifn-γ，有效地特异性杀伤bcma+靶细胞，具有良好的体内杀瘤活性，不仅可以显著抑制肿瘤细胞在小鼠体内的增殖，还能显著延长小鼠的生存时间。本发明的bcma-vhh car-t细胞抗肿瘤能力好，可用于bcma靶点相关疾病(如多发性骨髓瘤、慢性髓细胞白血病、b细胞急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤)的免疫治疗，具有广阔的临床应用前景。