一种檀香烯合成酶突变体以及应用

本发明属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种檀香烯合成酶突变体以及应用。

背景技术：

1、萜类是在自然界中广泛存在的一种天然化合物，以异戊二烯基焦磷酸和其异构体二甲基焦磷酸为基本单位聚合而成的化合物，包括单帖、倍半萜、二萜及多萜等。作为三大天然产物之一，萜类具有重要的生物学功能及广泛的应用价值，医疗保健、农业环保，新能源燃料及香料日化等。倍半萜类化合物表现尤为突出，檀香烯是檀香精油生产中的重要组成成分，由于其具有的独特香气及淡化疤痕滋润皮肤的能力，被广泛的应用于美容护肤行业，此外还具有抗菌、抗氧化和抗癌性等多种药理作用，具有重大的经济价值。目前檀香精油主要依靠檀香木进行提取，有限的自然资源限制了萜类化合物的高效生产；通过化学合成法进行合成檀香烯，反应条件苛刻，损失较大，成本昂贵，导致檀香油价格居高不下。因此，开发一种高效合成檀香烯的技术是提高檀香烯产量的关键。与传统的植物提取和化学合成工艺相比，运用合成生物学技术实现其微生物异源高效生产，不但可以摆脱资源和原材料的限制，而且环境友好特性突出，可持续性良好，是解决产品供需矛盾，突破产业瓶颈的有效手段。

2、酿酒酵母具有清晰的遗传背景，较高的生物安全性，较高的发酵密度，可用于生产高价值萜类化合物。倍半萜合酶属于i类萜类合酶，是可溶的酸性蛋白，分子量在35～80kda之间，通常具有两个高保守性区域即位于α螺旋上的ddxxd和nse/dte，催化反应一般需要3个二价金属离子如mg2+。天然倍半萜合酶的催化效率通常较低，因此通过整合关键合成元件，有利于提高最终产物的产量。

3、在萜烯类天然产物合成过程中，关键步骤的限速酶催化效率低，极大程度上限制了产物的合成效率。在檀香烯合成过程中，檀香烯萜合酶(santalene synthase)tps催化效率过低，限制产物的合成，我们通过对酶的分子改造进而提高催化效率，此外通过选择酿酒酵母上不同的多拷贝位点提高基因的表达量，以期获得酿酒酵母生产檀香烯的基因组整合高产量菌。

技术实现思路

1、为了解决现有技术中的不足，本发明提供一种檀香烯合酶突变体以及应用。本发明提供了如下的技术方案：一种檀香烯合酶tps突变体，其特征在于：所述檀香烯合酶突变体，为突变体h42l、l296e、r451k、i463v、m501t中的任一种。

2、本发明的第一方面，提供本发明所述的檀香烯合酶突变体的一种优选方案，其中，所述檀香烯合酶tps突变体以seq id no.1所示的野生型tps酶为模版，第42位组氨酸突变为亮氨酸的突变体h42l，氨基酸序列为seq id no.3所示；核苷酸序列为seq id no.4所示；第296位亮氨酸突变为谷氨酸的突变体l296e，氨基酸序列为seq id no.5所示；核苷酸序列为seq id no.6所示；第451位精氨酸突变为赖氨酸的突变体r451k，氨基酸序列为seq idno.7所示；核苷酸序列为seq id no.8所示；第463位异亮氨酸突变为颉氨酸的突变体i463v，氨基酸序列为seq id no.9所示；核苷酸序列为seq id no.10所示；第501位甲硫氨酸突变为苏氨酸的m501t，氨基酸序列为seq id no.11所示；核苷酸序列为seq id no.12所示。

3、本发明的第二方面，提供一种包含所述檀香烯合酶突变体的编码基因的重组表达载体，所述重组表达载体中的质粒为pesc-ura，启动子为诱导性启动子gal1，但应当理解的是，本发明包括但不限于该重组表达载体及启动子。

4、所述野生型檀香烯合酶tps来源于植物黄皮(clausenalansium)，所述野生型tps酶基因核苷酸序列为seq id no.2所示。

5、本发明的第三方面，提供一种酵母菌株上不同拷贝数位点的选择方案，可将上述檀香烯合酶突变体h42l、l296e、r451k、i463v、m501t，整合到ho位点、deltal位点和rdna位点，得到整合在不同拷贝位点的檀香烯合成酵母基因组工程菌株。

6、檀香烯合酶突变体的制备方法，包括，将野生型tps酶基因连接到质粒pesc-ura中，得到重组质粒pesc-ura-tps；设计突变引物，以质粒pesc-ura-tps为模版进行pcr扩增，酶切消化得到突变产物；设计重组引物，将突变产物构建到宿主细胞不同的多拷贝数位点，ho位点、deltal位点和rdna位点。

7、所述设计突变引物，其中突变引物序列包括，

8、h42l-f：核苷酸序列如seq id no.13所示；h42l-r：核苷酸序列如seq id no.14所示；h42l-f和h42l-r用于获得突变体h42l；

9、l296e-f：核苷酸序列如seq id no.15所示；l296e-r：核苷酸序列如seq id no.16所示；l296e-f和l296e-r用于获得突变体l296e；

10、r451k-f：核苷酸序列如seq id no.17所示；r451k-r：核苷酸序列如seq id no.18所示；r451k-f和r451k-r用于获得突变体r451k；

11、i463v-f：核苷酸序列如seq id no.19所示；i463v-r：核苷酸序列如seq id no.20所示；i463v-f和i463v-r用于获得突变体i463v；

12、m501t-f：核苷酸序列如seq id no.21所示；m501t-r：核苷酸序列如seq id no.22所示；m501t-f和m501t-r用于获得突变体m501t；

13、其中重组引物序列包括，

14、ho-f：核苷酸序列如seq id no.23所示；ho-r：核苷酸序列如seq id no.24所示；ho-f和ho-r将突变体tps整合在ho位点；

15、deltal-f：核苷酸序列如seq id no.25所示；deltal-r：核苷酸序列如seq idno.26所示；deltal-f和deltal-r将突变体tps整合在deltal位点；

16、rdna-f：核苷酸序列如seq id no.27所示；rdna-r：核苷酸序列如seq id no.28所示；rdna-f和rdna-r将突变体tps整合在rdna位点；

17、所述pcr扩增，包括，

18、pcr反应体系，phanta max buffer 25μl，f/r primer 1μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，dntp mix 1μl，cdna1μl，ddh2o 20μl；

19、pcr反应扩增程序：95℃预变性3min，95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸45s，进行28个循环，72℃5min，4℃保存。

20、所述将突变产物构建到宿主细胞不同的多拷贝数位点，包括，pcr扩增，

21、pcr反应体系，mix 25μl，f/r primer 1μl，目标片段产物1μl，ddh2o22μl；

22、pcr反应扩增程序：95℃预变性3min，95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸45s，进行11个循环，72℃5min，4℃保存。

23、所述的宿主细胞为酿酒酵母的感受态。

24、所述的檀香烯合酶tps突变体的制备方法，还包括将所述筛选得到的檀香烯合酶tps突变体表达菌株，具体为送测序验证氨基酸是否突变成功，进行筛选。

25、所述檀香烯合酶tps突变体在发酵生产檀香烯中的应用。

26、本发明的有益效果：

27、本发明提供一种生产檀香烯的方法，具体方法为，以酿酒酵母为宿主，在酵母基因组不同的拷贝位点整合檀香烯合酶突变体的基因，得到酵母工程菌株；将所述工程菌株接种到亮氨酸缺陷型选择性培养基中发酵，在发酵24h时添加终浓度为10g/l的半乳糖进行蛋白的诱导表达，同时添加10％正十二烷进行双相发酵培养，从而获得包含檀香烯的产物。

28、整合在ho位点野生型檀香烯合酶的摇瓶产量50mg/l，而檀香烯合酶突变体h42l、l296e、r451k、i463v、m501t产量分别为183mg/l、189mg/l、192mg/l、178mg/l、186mg/l，均高于野生型檀香烯合酶的摇瓶产量。其中整合在deltal位点和rdna位点的点突变组合檀香烯合酶突变体，摇瓶产量高达900mg/l，是野生型的18倍。

29、选取摇瓶产量优势表达的檀香烯合酶突变体进行5l发酵罐发酵，最终檀香烯产量为22g/l。

30、本发明通过选择性突变野生型檀香烯合酶，得到檀香烯合酶突变体，对于高效生成檀香烯有重要意义。