一种多不饱和脂肪酸和儿茶素修饰的纳米载体材料及其核酸转染应用

本发明属于生物医用高分子材料领域，具体涉及一种多不饱和脂肪酸和儿茶素修饰的纳米载体材料及其核酸转染应用。

背景技术：

1、核酸转染是一种将具生物功能的基因核酸传递到细胞内并使核酸在细胞内维持其生物功能的技术，该技术在近几十年发展十分迅速，可以用于治疗诸如癌症、神经纤维瘤病、肌肉营养不良等由基因损伤而导致的遗传性疾病或制成新颖的mrna疫苗。

2、由于核酸本身带有负电荷难以通过同样带负电的细胞膜且裸露的核酸不稳定容易酶解失活因此有必要寻找合适的载体起到递送和保护核酸的作用。目前常用的载体材料主要为脂质体纳米颗粒(lnp)或以聚乙酰亚胺(pei)、超支化聚赖氨酸(hbpl)为代表的聚阳离子高分子材料。

3、然而传统的核酸载体存在着一些局限，例如pei为代表的聚阳离子载体材料仅依赖静电与细胞膜作用，其作用单一，载体进入细胞的驱动力也单一，难以完成高效基因转染，且高分子量聚阳离子核酸载体虽转染效率更高，但细胞毒性大，生物相容性不好；hbpl作为优秀的无毒载体材料转染效率虽然较为理想，但同样作为单纯的阳离子聚合物对mrna、sirna等易于被环境中大量存在的rna酶所降解的核酸没有额外的保护作用，在转染过程中无法保证核酸的结构、功能完整性；现有lnp载体属于复杂的多组分物理混合体系，制剂的保存条件非常苛刻，需要超低温保存成本高昂；此外现有单种载体材料一般仅对特定的核酸具有较好的转染效率，不具有广泛适用性。因此迫切需要开发一种多驱动力协同具备高转染效率、高生物安全性、核酸适用范围广且材料本身性质稳定的载体材料。为解决以上现有载体存在的种种不足，本发明构筑的纳米载体材料在多种组分官能团的协同作用下，作为一种整体材料兼具高转染效率、高生物相容性、对不同尺寸不同性质核酸保护作用更强、高核酸适用范围和应用操作简单易于保存稳定性高等优势。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有核酸载体体系的不足，提供一种多不饱和脂肪酸和儿茶素修饰的纳米载体材料及其应用。

2、一种多不饱和脂肪酸和儿茶素修饰的纳米载体材料，该载体材料含有中低分子量、高分散系数、低细胞毒性的超支化聚赖氨酸(hbpl)以及多不饱和脂肪酸和儿茶素基团。该纳米载体材料与高分子量核酸载体(pei)相比转染效率更佳，但细胞毒性明显更低，生物相容性更好。该纳米载体材料可以与核酸形成复合物纳米粒子，并高效稳定将核酸传递入细胞内达到转染目的。

3、所述的hbpl分子量分布为mw：4000-25000da；pdi：1.5-3.5。

4、所述的核酸包括但不限于质粒dna、mrna、sirna、反义寡核苷酸和脱氧核酶。

5、所述的复合物纳米粒子的水合粒径为200-500nm，该较大尺寸的纳米粒子可通过巨胞饮路径更高效地穿过细胞膜进而达到更高的转染效率。

6、优选地，所述纳米载体材料与所负载的核酸的质量比为1:1到20:1。

7、所述的纳米载体通过以下方法制备：首先，儿茶素与琥珀酸酐反应制备儿茶素琥珀酯酸；然后，将儿茶素琥珀酯酸和多不饱和脂肪酸经edc/nhs试剂活化羧基后与hbpl分子链上的氨基反应形成酰胺键制得。

8、其中，进一步地，所述的儿茶素为表儿茶素(ec)、表没食子儿茶素(egc)、表儿茶素没食子酸酯(ecg)和表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)及其衍生物中的至少一种。

9、进一步地，所述的多不饱和脂肪酸为含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。

10、进一步地，儿茶素与hbpl的投料摩尔比为(0.05～0.5):1；多不饱和脂肪酸与hbpl的投料摩尔比为(0.05～0.3):1。

11、纳米载体材料与核酸结合的具体过程为：首先，载体分子上的儿茶素基团与核酸形成带负电前体复合物，然后，载体分子中hbpl的质子化带正电氨基随之与该带负电前体复合物通过静电引力作用进一步压缩形成直径200-500nm的载体-核酸复合物纳米粒子，同时载体分子上疏水的多不饱和脂肪酸部分则分布在复合物外层通过疏水作用起到促进复合物融合穿透细胞膜的作用。

12、本发明的纳米载体材料，主要组分为多不饱和脂肪酸和儿茶素修饰的中低分子量hbpl，具有制备过程简单、生产成本低、性质稳定不需苛刻储存条件、转染效率高和生物相容性好等优点。在生理ph下，该载体材料发生质子化，并通过多不饱和脂肪酸和儿茶素基团的协同作用与核酸结合压缩形成更易透过细胞膜的复合物纳米粒子，将所负载的核酸传递入细胞，再进一步于细胞内进行核酸的转录、翻译、沉默和表达等功能过程。与现有的标准聚阳离子核酸转染载体pei相比，本发明中的纳米载体材料表现出更高的转染效率和更低的细胞毒性，有望在转染科研、基因治疗、核酸疫苗等领域发挥作用。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明构筑的纳米载体平台使用中低分子量、高分散系数、低细胞毒性的超支化聚赖氨酸(hbpl)在共价结合的多不饱和脂肪酸和儿茶素辅助基团的协同作用下达到高转染效率、高核酸适应范围、高生物相容性的效果。优选的hbpl分子量分布：4k-25k da，pdi：1.5-3.5，不含内毒素和重金属，不会由于分子量过大(>30k)正电荷密度过高而产生明显的细胞毒性。作为纳米载体核心组分，得益于hbpl分子内质子化的氨基官能团所带的大量正电荷可以有效结合带负电的核酸形成复合物；此外hbpl依靠大量的活性氨基官能团可作为其他功能组分的修饰锚点，修饰策略灵活多样；而且所用的hbpl相较其他聚阳离子载体材料在ph＝4-7范围内具有更大的缓冲容量，质子海绵效应更强，利于胞内溶酶体逃逸顺利释放核酸，提高转染效率。所用hbpl具有较大的pdi，分子量分布较宽广，针对不同核苷酸数目不同尺寸的核酸均有合适区间的hbpl载体与其配合，高效结合成合适稳定度的载体-核酸复合物，适应范围广，可兼容质粒dna、mrna、sirna、反义寡核苷酸和脱氧核酶等尺寸大小差别跨度较大的不同类型核酸的转染需求。

15、该纳米载体材料包含共价结合于hbpl的儿茶素基团。儿茶素作为天然多酚具有清除自由基、抗氧化应激等作用且与基因核酸分子具有极强的亲和力，会率先与核酸结合形成较松散的带负电复合物并发挥保护核酸作用，防止核酸被活性自由基氧化、酶解；同时协同带正电的hbpl组分最终形成直径200-500nm的纳米粒子，该尺寸复合物可避开网格蛋白介导的胞吞过程，利于后续溶酶体逃逸及核酸释放表达过程；由于儿茶素的辅助作用可以强化电荷密度较低(细胞毒性也较低)的中低分子量hbpl的转染效果，最终可以兼具高分子量阳离子聚合物载体同级别的高转染效率和相对较低的细胞毒性。

16、该纳米载体材料含有共价结合于hbpl的多不饱和脂肪酸基团。多不饱和脂肪酸作为疏水部分裸露在复合物纳米粒子的外围区域，提高复合物与疏水细胞膜的亲和性提高纳米粒子过膜效率；该疏水修饰可以促进复合物纳米粒子在水相中形成大尺寸聚集体吸附于细胞膜表面，以巨胞饮形式高效通过细胞膜，有利于提高转染效率。此外多不饱和脂肪酸依靠不饱和双键具备抗自由基氧化性，本身又是生物体脑、眼和神经等组织结构的重要构成成分，生物安全性高，可提高载体面对活性氧自由基侵袭时的稳定性并使载体平台整体保持低细胞毒性。