利用多重PCR检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合、试剂盒及方法

本发明涉及生物，具体涉及利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合、试剂盒及方法。

背景技术：

1、拟柱孢藻是属于蓝藻门、念珠藻目的一种淡水蓝藻，在中国是一种入侵物种。由于其独特的生理特征，包括优秀的固氮功能、低光适应机制、广温性、灵活的磷利用策略以及耐受光强波动，增强了其入侵性、忍耐性和扩张性。拟柱孢藻分泌的拟柱孢藻毒素，对饮用水安全和公共卫生构成了巨大挑战。目前拟柱孢藻自南向北，从热带亚热带地区向温带地区不断扩散，此外，福建、云南、湖北、太湖流域以及山东等地也均检测到拟柱孢藻的存在。基于其藻毒素对水质安全的隐患以及形成水华对生态多样性的破坏，所以，建立一种快速准确鉴别拟柱孢藻的方法有重要意义。

2、环境dna是指从环境样本中直接获取的dna，包括动植物、微生物在空气、土壤、水体等环境中释放的dna。环境dna技术是指从环境样品中直接提取目的基因片段后利用各种分子技术进行定性或定量分析的方法。利用环境dna技术可以有效检测到水体中的隐秘物种，如处于初步入侵阶段、生物量较少的入侵物种，提高调查结果的准确性。但是难度在于环境样本环境复杂，干扰大，很难在多物种dna甚至多相近物种dna背景下鉴定出目标物种。

3、目前有利用pcr技术检测水体中蓝藻dna的技术，如专利申请cn102286619a公开了的一种利用pcr方法检测水体中蓝藻种类的方法，其特点是用一对蓝藻通用引物扩增多个蓝藻。相较于传统显微镜镜检法，该方法效率高，受人为经验等因素影响小。但该方法所开发的引物为蓝藻通用性引物，对所有蓝藻目标片段均能有效扩增。而当入侵物种拟柱孢藻未成为优势种，水样中拟柱孢藻浓度低，非目标蓝藻浓度高时，拟柱孢藻dna含量低，对通用引物的竞争力不及含量高的非目标蓝藻dna，最终导致拟柱孢藻的目标片段扩增少或没有,也无法直接通过胶图初步判别拟柱孢藻的有无，测序结果产生偏差。因此，建立一种新型、灵敏度高、特异性强的针对入侵物种拟柱孢藻的检测方法十分有必要。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明的目的之一是提供一种利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合，能够在复杂背景下特异性扩增出拟柱孢藻dna。

2、具体的，所述引物组合选自以下六种引物组合之一：

3、引物组合ⅰ：cyra-1引物对、cyra-2引物对、cyra-3引物对；

4、引物组合ⅱ：cyra-1引物对、cyra-2引物对、cyra-5引物对；

5、引物组合ⅲ：cyra-1引物对、cyra-2引物对、cyra-6引物对；

6、引物组合ⅳ：cyra-2引物对、cyra-3引物对、cyra-5引物对；

7、引物组合ⅴ：cyra-2引物对、cyra-3引物对、cyra-6引物对；

8、引物组合ⅵ：cyra-3引物对、cyra-5引物对、cyra-6引物对；

9、所述cyra-1引物对的核苷酸序列如seq id no.1-seq id no.2所示；所述cyra-2引物对的核苷酸序列如seq id no.3-seq id no.4所示；所述cyra-3引物对的核苷酸序列如seq id no.5-seq id no.6所示；所述cyra-5引物对的核苷酸序列如seq id no7-seq idno.8所示；所述cyra-6引物对的核苷酸序列如seq id no.9-seq id no.10所示。

10、本发明的目的之二是提供包括上述多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合的试剂盒。

11、优选的，所述利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的试剂盒还包括taq酶、pcr缓冲液和无菌无酶水。所述pcr缓冲液为包含dntp、mg2+等组分的常规的可购买到的用于pcr反应的缓冲液。

12、优选的，所述利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的试剂盒还包括正对照dna。所述正对照dna为拟柱孢藻基因组dna，作为阳性对照，具体为中国科学院淡水藻种库编号为fachb-1503、浓度为1000ng/ml的拟柱孢藻dna提取液。

13、本发明的目的之三是提供利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法，为拟柱孢藻在淡水环境中的快速准确的多引物、多目标条带的检测方法，是能够将优化后的藻类水样dna提取技术与多重pcr技术结合的一种拟柱孢藻多重pcr检测方法。该方法可节省时间，节省成本，灵敏性高、特异性强、效率高、专业要求低，当目标物种浓度低时检出率更为良好，且可以通过胶图判断。

14、具体的，所述利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法包括以下步骤：s1.水样抽提：利用滤膜进行待测水样过滤，抽滤后将滤膜放至灭菌离心管；

15、s2.edna水样提取：利用ctab法提取抽滤后滤膜中的edna；

16、s3.多重pcr扩增：利用上述试剂盒对提取到的edna进行多重pcr扩增反应；

17、s4.电泳检测：对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束于凝胶成像仪中观察亮带情况，根据是否出现目标片段的亮带判断有无拟柱孢藻的存在。

18、优选的，步骤s1中，所述滤膜为混合纤维素膜，滤径为0.45μm，以充分截留edna，减少提取损失。

19、优选的，步骤s3中，多重pcr扩增的反应体系为：takara taq酶5μl、edna模板0.8μl，引物组合中每条引物0.4μl，无菌无酶水补足至10μl。

20、优选的，步骤s3中，多重pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；98.0℃变性20s、60℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应6次；98.0℃变性20s、58℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应6次；98.0℃变性20s、56℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应20次；最后72℃延伸5min。梯度循环反应的设计能够有效减少引物之间的干扰，改善扩增效果。

21、本发明具有以下有益效果：

22、本发明创新了引物设计方法，筛选出优势拟柱孢藻多重pcr引物，结合优化的pcr反应体系和条件，能够在多种类蓝藻背景下检测出拟柱孢藻dna，特异性强，准确性高，灵敏度高，解决了环境edna检测存在的难题，能够将多重pcr引物与环境edna检测结合，实现更精准地监测拟柱孢藻的动向，为该物种的入侵情况积累资料，为监测入侵物种和生态保护提供了新的科学方法。

技术特征：

1.利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合，其特征在于：为以下六种引物组合之一：

2.利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合。

3.根据权利要求2所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的试剂盒，其特征在于：还包括taq酶、pcr缓冲液和无菌无酶水。

4.根据权利要求3所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的试剂盒，其特征在于：还包括正对照dna。

5.利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法，其特征在于：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法，其特征在于：步骤s1中，所述滤膜为混合纤维素膜，滤径为0.45微米。

7.根据权利要求5所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法，其特征在于：步骤s3中，多重pcr扩增的反应体系为：takara taq酶5μl、edna模板0.8μl，引物组合中每条引物0.4μl，无菌无酶水补足至10μl；

8.根据权利要求5所述的利用多重pcr检测水中入侵物种拟柱孢藻的方法，其特征在于：步骤s3中，多重pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3min；98.0℃变性20s、60℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应6次；98.0℃变性20s、58℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应6次；98.0℃变性20s、56℃退火15s、72℃延伸15s，循环反应20次；最后72℃延伸5min。

技术总结
本发明属于生物技术领域，具体公开了利用多重PCR检测水中入侵物种拟柱孢藻的引物组合、试剂盒及方法。本发明创新了引物设计方法，筛选出六种优势拟柱孢藻多重PCR引物组合，结合优化的PCR反应体系和条件，能够在多种类蓝藻背景下检测出拟柱孢藻DNA，解决了环境eDNA检测存在的难题，能够将多重PCR检测与环境eDNA检测结合，实现更精准地监测拟柱孢藻的动向。本发明检测方法可有效节省时间，节省成本，灵敏性高、特异性强、效率高、专业要求低，当目标物种浓度低时检出率更为良好，且可以通过胶图判断。

技术研发人员：李晨虹,陈子涵,王辉
受保护的技术使用者：上海海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/4/17