一种重组酵母工程菌株及其制备和在降解PET塑料中的应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种高效重组表达pet塑料水解酶的酵母工程菌株及其制备方法，并利用该重组酵母的全细胞直接降解pet(polyehyleneterephthalate)塑料。

背景技术：

1、pet塑料是由对苯二甲酸(tpa)和乙二醇组成的线性聚合物，强度高，易制成纤维和薄膜，主要用于制作一次性水瓶、食品和药品的包装材料等，还广泛用作柔性电路板、电容器膜等电器绝缘材料。pet塑料的优良性能让其被应用在生活中的方方面面，极大地便利了人们的生活，2018年的全球pet塑料生产量为3.59亿吨，2019年增长到3.68亿吨。但是，pet塑料稳定难分解的性质又让它的回收利用变得极端困难，其在自然环境中不能有效降解，而是经过各种因素作用逐渐崩解成细小碎片，经由地下水地表河流等汇聚海洋，对土壤和海洋造成严重污染。目前对于塑料废弃物的处理方法主要是焚烧和填埋，产生的有害物质(如二噁英等)会造成严重的二次环境污染，如何通过绿色环保的方式处理塑料废弃物一直是世界难题。

2、近年来，pet塑料的生物降解已经取得了令人瞩目的进展。pet作为人工合成的高分子聚合物，在地球上存在的时间不到百年，自然界还没有进化出能够能特异性降解pet塑料的酶。2005年，muller等人从pet分子里大量存在的酯键入手，首次利用thermobifidafusca来源的角质酶tfpetase实现了pet塑料的水解，随后通过序列比对陆续发现多种具有pet降解能力的酶，如lcc(leaf-branch compost cutinase)、ispetase(ideonella sakaiensis201-f6)、phl7等，这些酶都是水解酶，能够在常温或者高温条件下将pet降解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(mhet)、对苯二甲酸(tpa)和乙二醇。同时，通过机器学习和理性设计的方式对这些pet塑料水解酶进行改造，已产生多种稳定性和活性均显著提高的突变体。其中，lcc是一种从堆肥的宏基因组中找到的pet塑料水解酶，其最适反应温度65℃，具有较好的耐热性。通过理性设计和引入二硫键获得的突变体iccg、wccg的pet塑料水解活性大幅提升，热稳定性也显著提高，反应温度达到72℃，适应pet塑料解聚所需要的高温条件。

3、随着这些酶资源的挖掘和改造，如何高效重组表达pet塑料水解酶及其突变体，并建立相关水解工业成为亟待解决的问题。大肠杆菌重组表达lcc突变体iccg(即lcciccg)的产量低，不能满足工业化生产的要求。毕赤酵母是常用的重组表达宿主，具有遗传背景清楚，操作简单，可高密度发酵、发酵成本低等特点。在之前的研究中，发明人团队已经成功实现了ispetase在毕赤酵母中的分泌表达(cn115927248a)，但是采用毕赤酵母进行重组表达时并没有规律，即并不是所有的pet塑料降解酶都可以通过毕赤酵母实现高表达。目前尚未见利用毕赤酵母胞高效表达lcciccg的报道，也未见利用重组毕赤酵母全细胞水解pet塑料的技术。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在提供一种能够高效表达pet塑料水解酶的重组酵母菌株，为pet塑料水解酶的工业生产和pet塑料的绿色循环利用提供新的途径。

2、本发明的技术方案具体如下：

3、本发明第一方面提供了一种能够降解pet塑料的重组酵母工程菌株，具体地，所述重组酵母工程菌株能够胞内表达耐热塑料水解酶，所述耐热塑料水解酶在≥70℃的环境下具有降解pet塑料的活性。

4、优选地，在上述重组酵母工程菌株中，所述耐热塑料水解酶为lcciccg。

5、优选地，在上述重组酵母工程菌株中，所述酵母为毕赤酵母。

6、发明人发现虽然不能通过毕赤酵母分泌表达的方式实现pet塑料水解酶lcciccg的高表达，但是可以通过毕赤酵母胞内表达的方式实现该基因的高水平表达。更重要的是，发明人发现在高温(如72℃)条件下处理含有目的蛋白的重组毕赤酵母菌体和重组大肠杆菌菌体时，重组毕赤酵母中的lcciccg的稳定性显著高于重组大肠杆菌中的lcciccg，这更有利满足pet塑料解聚所需要的高温条件。

7、本发明第二方面提供了本发明所述重组酵母工程菌株的制备方法，具体为：构建携带有一个或多个目的基因拷贝的重组质粒，将重组质粒转化至酵母细胞中即得。

8、优选地，在上述制备方法中，所述重组酵母工程菌株胞内高水平表达pet塑料水解酶lcciccg,且所述目的基因的序列如seq id no.1所示。

9、优选地，在上述制备方法中，所述重组质粒的制备方法为：按照t5核酸外切酶介导的克隆方法，对耐热塑料水解酶编码基因和表达载体phbm905m分别进行pcr扩增，产物分别回收后混合，加入t5核酸外切酶后冰浴孵育，然后转化大肠杆菌，鉴定获取重组载体，再通过生物砖的方法构建携带有两个及以上目的基因拷贝的重组质粒。

10、在本发明一实施例中，目的基因的序列如seq id no.1所示，且目的基因的拷贝数为3，将得到的重组质粒phbm905m-iccg-3转化至毕赤酵母gs115菌株中得到了pet塑料水解酶lcciccg重组表达的工程菌株，通过甲醇诱导，即可实现pet塑料降解酶lcciccg在毕赤酵母中的高效表达，且sds-page检测结果显示其为胞内表达。

11、本发明第三方面提供了本发明所述重组酵母工程菌株在pet塑料降解中的应用，具体为：将重组酵母工程菌株诱导发酵后，取发酵后的菌体直接在≥70℃的环境下进行pet塑料降解，且降解产物包括tpa和mhet。

12、优选地，在上述应用中，所述诱导采用甲醇进行。

13、本发明提供的重组酵母工程菌株虽然不能分泌表达pet塑料水解酶，但鉴于其胞内表达的pet塑料水解酶具有优异的热稳定性而酵母内源蛋白在达到一定高温条件后变性失活的特点，本发明可直接利用重组酵母工程菌株全细胞在高温条件(如72℃)下对pet塑料进行降解，而且该方法无需蛋白质纯化、浓缩过程，生产成本低，操作简便。

14、相对于现有技术，本发明的有益效果为：

15、(1)本发明首次利用毕赤酵母细胞高效表达了pet塑料水解酶lcciccg，且其表达方式为胞内表达；实验数据表明，相对于大肠杆菌胞内表达的lcciccg，本发明利用重组毕赤酵母菌体生产的lcciccg具有良好的热稳定性，在48h内未见明显的变性失活，而大肠杆菌胞内表达的lcciccg并不稳定，短时间内会迅速变性。

16、(2)本发明利用重组毕赤酵母菌体生产的lcciccg具有良好热稳定性的特点，以及毕赤酵母内源蛋白酶不耐热的特点，开发了一种直接利用发酵后的重组毕赤酵母菌体在高温下水解pet塑料的方法；在该方法中，毕赤酵母在高温环境下细胞受热裂解，释放胞内蛋白(包括lcciccg)，其内源蛋白酶被加热变性除去，而外源蛋白lcciccg却能在该高温环境中长时间保持活性，从而实现pet塑料的高效降解，降解产物主要是tpa和mhet。

17、(3)本发明提供了利用含有重组pet塑料降解酶lcciccg的毕赤酵母全细胞进行pet塑料制品水解的方法，该方法无需蛋白质纯化、浓缩过程，生产成本低，操作简便；本发明一实施例数据表明，24h内1.25g菌体可以完全降解5.87gpet塑料托盘；可见，本发明为pet塑料的绿色循环利用提供了可能，具有工业应用价值。