一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用。

背景技术：

1、由于能实现基因在生物体内的短时间高效表达，基于原生质体的瞬时表达系统(protoplast-based transient expression system,ptes)在分子生物学研究中表现出巨大的优势，被广泛应用于亚细胞定位、蛋白互作、转录调控和信号转导等方面的研究中。目前，原生质体瞬时表达系统在拟南芥、烟草、水稻、玉米和花生等作物研究中得到了完善的建立和发展。近些年，将原生质体瞬时表达与基因组学、蛋白组学和遗传改良等结合的研究使其应用范围得到进一步拓宽。

2、原生质体瞬时表达系统包括原生质体的分离与转化，其中原生质体转化是指通过聚乙二醇或电穿孔的方式将外源核酸引入原生质体中。许多物种的基因瞬时表达依靠质粒作为载体，将基因表达盒与质粒融合递送到原生质体内，dna不需要整合到植物的基因组中，而能够在细胞中进行快速表达。虽然这种方法能够赋予细胞适当的转基因表达水平，但是在前期需要构建基因表达载体，抽提高质量的质粒，从而增加了实验时间，且通量较低。在研究中，为了获得可靠且可重复的结果，需要较高的转化效率。除了原生质体的活力和数量，peg的浓度和转化孵育时间外，dna的数量和质量也是影响转化效率的关键。然而，研究显示随着质粒dna大小从5kb增加到10kb，转化效率急剧下降。因此，需要使用大量的质粒dna才能达到一定的转化效率。此外，内毒素是质粒dna抽提过程中常见的污染物之一，而内毒素的存在会对细胞造成伤害，导致原生质体转化效率大打折扣。

3、现有的原生质体瞬时表达系统的局限性促使我们开发一种简单、快速、高通量的基因瞬时表达方法。通过golden gate法在体外构建dna片段基因表达盒，将纯化后的dna片段直接进行原生质体转化，不仅避免了构建载体和抽提质粒的繁琐程序，使得实验时间大大缩短，也排除了细菌内毒素污染的可能，有利于提升转化效率。单纯的基因表达盒相比于与质粒融合的表达载体，具有片段小的优势，并且可以通过pcr扩增在短时间内大量制备，为高通量高效率基因瞬时表达提供可能，是一种非常有应用潜力的基因瞬时表达方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中植物原生质体瞬时表达耗时长、操作复杂繁琐、成本高的问题，本发明提供了一种高效的片段组装方法并应用于快速的植物细胞原生质体瞬时表达系统，基于合成生物学的方法制备基因表达盒转化入原生质体内，实现耗时短、见效快、操作简单的基因瞬时表达。

2、具体的，本发明的技术方案如下：

3、第一方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法，包括如下步骤：

4、s1、以dna为模板，通过pcr扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列；

5、s2、利用golden gate法将启动子、基因编码区和终止子dna片段融合为一个完整的基因表达盒；

6、s3、利用pcr扩增富集完整的基因表达盒；

7、s4、将富集的dna片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现基因的瞬时表达。

8、在本发明中，从模板dna中扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列。

9、在本发明中，所述模板dna可以是包含dna底物的缓冲液，也可以是包含dna的微生物、植物组织、动物组织。

10、在本发明中，所述包含模板dna的缓冲液包括但不限于线性dna片段，双链dna片段，多链(大于等于三链)dna片段，dna与rna杂合的片段，环状dna序列，正常天然dna结构，修饰过的dna结构等。

11、在本发明中，所述dna片段来源可以是天然的动植物dna或微生物dna，也可以是化学或生物合成dna，包括正常dna结构及修饰过的dna结构。

12、在本发明中，作为底物的dna包括反应时直接添加的dna，也包括反应前未直接添加但在反应过程中出现的dna，例如rt-pcr反应(reverse transcription polymerasechain reaction)，将rna反转录成dna，再利用dna进行后续的扩增。

13、在本发明所述的一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法中，

14、优选的，步骤s1的启动子35s和终止子来源于pcambia1301载体，基因编码序列sfgfp为本室合成，序列如seq id no.1所示。

15、优选的，步骤s1中以pcambia1301质粒为模板，35s-f和35s-r(序列如seq id no.2和seq idno.3所示)为引物，利用高保真酶(cloneamp hifi pcr premix，takara)扩增35s启动子(3’端引物带有bsaⅰ酶切位点和保护碱基)。以sfgfp合成质粒为模板，以sfgfp-f和sfgfp-r(序列如seq id no.4和seq id no.5所示)为引物，扩增sfgfp基因(引物两端带有bsaⅰ酶切位点和保护碱基)。以pcambia1301质粒为模板，nos-f和nos-r(序列如seq idno.6和seq id no.7所示)为引物，利用高保真酶(cloneamp hifi pcr premix，takara)扩增nos终止子(5’端引物带有bsaⅰ酶切位点和保护碱基)。

16、在本发明中，选用的限制性内切酶是bsaⅰ。经验表明即使目标片段(基因)中存在bsaⅰ的识别位点，也不会影响后续片段组装与扩增。

17、优选的，通过pcr扩增获得启动子、基因编码区和终止子序列后，利用磁珠法(产品名称：ampure xp核酸纯化试剂盒，货号：a63882)将pcr产物进行纯化。

18、在本发明中，利用golden gate法将启动子、基因编码区和终止子dna片段融合为一个完整的基因表达盒。

19、优选的，在步骤s2中，将启动子、基因编码区和终止子dna片段与限制性内切酶bsaⅰ、t4dna连接酶混合进行酶切连接反应，酶切连接反应体系如下：

20、 10×t4dnaligasebuffer(neb) 1μl 10×cutsmartbuffer(neb) 1μl t4dnaligase(neb) 1μl bsaⅰ(neb) 0.5μl 每片段 100ng <![cdata[补ddh₂o]]> 至20μl

21、优选的，酶切连接反应在室温条件下反应15min。

22、在本发明中，利用pcr扩增富集完整的基因表达盒。

23、优选的，在步骤s3中，将步骤s2反应后的组装产物稀释20倍作为pcr反应模板，以35s-f和nos-r为引物，利用高保真酶扩增完整表达盒，然后利用磁珠法将pcr产物进行纯化。

24、优选的，完整dna片段基因表达盒扩增体系如下：

25、 2×cloneamphifipcrpremix(takara) 25μl 35s-f 1μl nos-r 1μl 组装产物 1μl <![cdata[ddh₂o]]> 22μl

26、反应程序：95℃5min，(95℃10s，72℃1min，35cycles)，72℃5min。

27、因涉及到多片段组装，为了提升表达盒的扩增特异性，在本发明中，特将35s-f和nos-r两条引物的tm值设置在68℃以上，采用两步法pcr扩增目标dna片段，大大提升了dna片段表达盒的扩增特异性。

28、在本发明中，优化后的片段组装方法可以实现最多5个片段同时组装，最终长度可达6kb以上。

29、优选的，将步骤s3富集的dna片段基因表达盒直接进行原生质体转化，实现基因的瞬时表达。

30、第二方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达系统，所述系统包括dna片段基因表达盒的组装反应体系、原生质体制备体系和原生质体转化体系。

31、进一步的，所述dna片段基因表达盒的组装反应体系包括启动子、基因编码区和终止子序列的pcr扩增反应体系、golden gate反应体系和基因表达盒的富集反应体系。

32、第三方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用。

33、第四方面，本发明提供了一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达系统在非疾病诊断和治疗目的的外源基因表达中的应用。

34、在本发明中，所述方法和系统的应用范围包括但不限于植物细胞、动物细胞。

35、在本发明中，所述基因瞬时表达方法应用于动植物中基因瞬时表达的相关产品，包括但不限于基因亚细胞定位相关产品、基因的功能类研究相关产品，基因相互作用相关产品，非编码基因功能研究相关产品，启动子序列的功能研究相关产品、终止子序列的功研究相关产品，非翻译区序列的功能研究相关产品。

36、在本发明中，所述应用的方式优选包括基因亚细胞定位、基因功能预测、基因相互作用中的至少一种；更优选的，所述基因功能预测包括非编码基因功能预测、启动子序列功能预测、终止子序列功能预测、非翻译区序列功能预测中的至少一种。

37、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

38、1、片段组装：优化了golden gate反应体系，使反应时间从传统的1.5h(maandliu,crispr/cas9-based multiplex genome editing in monocot anddicotplants,2016)缩短至15min。

39、2、提升了dna片段表达盒的扩增特异性：因涉及到多片段组装，为了提升表达盒的扩增特异性，特将35s-f和nos-r两条引物的tm值设置在68℃以上，采用两步法pcr扩增目标dna片段。

40、3、优化后的片段组装方法可以实现最多5个片段同时组装，最终长度可达6kb以上。

41、4、在发明中，选用的限制性内切酶是bsaⅰ。经验表明即使目标片段(基因)中存在bsaⅰ的识别位点，也不会影响后续片段组装与扩增。

42、5、在相同的摩尔量下，dna片段表达盒与质粒表达盒表现出同样的转化效率及表达量，最低只需要500ng表达盒就能达到实验目的。

43、6、整个实验过程所需时间从传统的7d缩短到2d。