复合诱导剂在制备中性蛋白酶发酵液中的应用的制作方法

本发明涉及微生物发酵，特别是指复合诱导剂在制备中性蛋白酶发酵液中的应用。

背景技术：

1、蛋白酶(protease)是在适宜的条件下作用于蛋白质肽键的一类酶，能够将蛋白质分解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸，在食品工业、生物医药、动物饲料等工业领域得到广泛应用。与国外相比，我国工业化的蛋白酶资源不足，高产蛋白酶的工艺体系缺乏更新，酶活力和产量有限。在食品行业中随着特殊功能性食品的发展，对中性蛋白酶的需求逐渐凸显。目前工业应用的蛋白酶种类多样，通常可将蛋白酶分为动物源蛋白酶、植物源蛋白酶以及微生物源蛋白酶，因微生物源蛋白酶的来源广泛、培养周期短、便于工程化操，使其成为国际上蛋白酶最主要的来源。而根据蛋白酶在不同ph范围内，具有高活性进行分类，将蛋白酶分为酸性(ph＝2.0～6.0)、中性(ph＝6.0～8.0)和碱性(ph＝8.0～13.0)三类。

2、中性蛋白酶(neutral protease)是指在ph为中性条件下作用于蛋白质肽键，将蛋白质水解成氨基酸、多肽以及游离氨基酸等物质的一类蛋白酶，通常可作为动植物蛋白水解剂，饲料添加剂，食品添加剂等广泛应用于工业领域。目前为止饲用中性蛋白酶在养殖动物中能够提高家养动物的生长性能、营养物质消化率和改善肠道健康等问题，因此可以利用其作为功能饲料添加剂生产动物饲料。

3、近年来，在构建枯草工程菌用于饲料添加剂的发酵研究方面，多集中于采用乳糖操纵子模型。此模型在发酵过程中，加入iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)，借助乳糖(lac)操纵子模型来诱导表达目的蛋白。但加入iptg使其存在明显的局限性：不能被菌体代谢，大规模应用较为昂贵，具有毒性。为此亟需寻找一种价格低廉且无毒害的诱导剂代替iptg进行发酵生产。

4、乳糖作为一种廉价且无毒的二糖，其可在蛋白诱导表达时代替iptg发挥诱导剂的作用，目前多用于诱导大肠杆菌的外源蛋白表达，研究多集中于应用在人体或动物体方面，诸如褐藻胶裂解酶、葡萄糖基转移酶、纤维二糖差向异构酶、d-塔格糖3-差向异构酶、抗菌肽等的发酵培养。乳糖本身作为一种碳源，能够被菌体代谢利用，并导致菌体的生理及生长特性发生变化。由于乳糖具有廉价、无毒优点，使得乳糖在重组蛋白的大规模生产中具有更大的优势。

5、申请人在公开号为cn107881181a的专利文献中公开了一株保藏编号为cgmccno.14836，拉丁文名称为bacillus subtilis的枯草芽孢杆菌，利用其培养制备的中性蛋白酶应用环境更为简单且能够耐受氯霉素。

6、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)cgmcc no.14836，其导入质粒属于典型的乳糖操纵子模型，其模型表达蛋白的方式是：当发酵过程中没有异乳糖参与，其代谢产生的阻遏蛋白将结合到操纵子中的操纵基因上，导致rna聚合酶不能与启动基因结合，结构基因也被抑制，进而不能转录出mrna，不能翻译目的蛋白。但当乳糖参与发酵时，乳糖借助于β-半乳糖苷酶透过酶的作用进入细胞内，经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖，引起阻遏蛋白构象发生改变，不能结合到操纵基因上，使编码rna聚合酶能正常催化转录操纵子上的结构基因，即操纵子被诱导表达。因此，乳糖作为诱导剂用来启动中性蛋白酶表达是有具体的理论依据支持。同时，由于乳糖作为碳源可以被微生物菌体所降解，参与糖代谢，使得其诱导作用较为短暂，诱导过程比iptg复杂的多，诱导效率也不如iptg，为此解决乳糖诱导效率低的问题十分必要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供复合诱导剂在制备中性蛋白酶发酵液中的应用，采用iptg与乳糖联合诱导等措施，通气培养保藏编号为cgmcc no.14836的枯草芽孢杆菌，进而达到降低生产成本，提高终产物产量的目的。

2、本发明的目的是这样实现的：

3、复合诱导剂在制备中性蛋白酶发酵液中的应用，是采用拉丁文名称为bacillussubtilis，保藏编号为cgmcc no.14836的枯草芽孢杆菌作为菌种，将其接种至含有碳源、氮源及必要生长因子的无菌发酵培养基，通气发酵制备含有中性蛋白酶的发酵液；加入氯霉素至其在培养基中的浓度不低于0.03％，发酵2～4小时加入由iptg及乳糖组成的复合诱导剂，iptg在发酵培养基中的浓度为0.025％～0.075％，乳糖在发酵培养基中的浓度为0.5％～1.125％；通气发酵温度为34℃～37℃，周期42～45小时。

4、因为保藏编号为cgmcc no.14836的枯草芽孢杆菌属于抗氯霉素的菌种，在发酵培养基中加入氯霉素的主要作用是防止杂菌生长，便于生产菌种良好生长并高效表达终产物，同时提高培养基中营养物质利用率。

5、本发明的具体技术构思还有：

6、发酵培养基由如下质量份数的原料组成：

7、玉米粉25～40；麸皮20～40；蛋白胨20～25；硫酸锰0.015～0.030；氯化钙0.01～0.05；磷酸氢二钠2.0～4.0；磷酸二氢钾0.2～0.4；水1000；ph＝6.5～7.5。

8、为保证发酵培养基中的溶氧，优选的技术实现手段是，通气发酵中发酵培养基装量50％～60％，溶氧30％～40％，通风量1：1.25～1.50，ph＝6.5～7.5。

9、采用磷酸或氨水调整ph。

10、为便于菌种的良好生长，优选的技术实现手段是，将保藏编号为cgmccno.14836的枯草芽孢杆菌活化处理后接种于无菌发酵培养基，具体条件为：从低温保存的甘油管取20μl的枯草芽孢杆菌接种至含有2yt培养基5ml的试管中培养过夜，2yt培养基中含有浓度不低于0.03％的氯霉素；次日取20μl菌液接种至相同的2yt液体培养基中，再次培养8～10小时，待菌液od600mm达到0.6时活化完成；培养温度为34℃～37℃，转速为180～220转/分钟。

11、为便于实现工业化生产，优选的技术实现手段是，将活化后的保藏编号为cgmccno.14836的枯草芽孢杆菌经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基的体积百分比为2％～4％的接种量接种于发酵培养基中。

12、所述的扩大培养过程包括：

13、(1)将活化后的保藏编号为cgmcc no.14836的枯草芽孢杆菌经扩大培养后制成种子液；

14、(2)将制成的种子液按种子液：发酵液的体积百分比为3％～5％的接种量接入发酵罐内无菌发酵培养基中，进行通气发酵。

15、所述的扩大培养过程步骤(1)中制备种子液的工艺条件是：将活化的种子液按体积百分比为3％～5％的接种量接种到含有以下原料组分的摇瓶培养基中，加入氯霉素至其在培养基中的浓度不低于0.03％，在温度为34℃～37℃，转速为180～220转/分钟的条件下培养42～45小时，培养2～4小时加入由iptg及乳糖组成的复合诱导剂，iptg在摇瓶培养基中的浓度为0.025％～0.075％，乳糖在摇瓶培养基中的浓度为0.5％～1.125％。

16、本发明所具备的实质性特点和取得的显著的技术进步在于：

17、1、申请人通过试验证实，采用本技术的方法通气发酵，一是能够有效实现中性蛋白酶的高效表达，大幅度提高了发酵终产物产量；摇瓶、5升发酵罐的产量分别由918.14u/ml、1178.43u/ml升高至1530.92u/ml、1868.32u/ml；二是降低了能耗，缩短了发酵周期并提高了生产效率，发酵周期由现有的48小时缩短至42～45小时。

18、2、采用本发明的方法与现有方法制备的中性蛋白酶相比，目的蛋白分子量以及酶学性质基本未改变。

19、3、本发明中的复合诱导剂对菌体生长，基本符合生长规律。

20、4、采用本发明中iptg与乳糖联合诱导枯草工程菌进行发酵生产，一是能够相比现有工艺节省iptg用量25％～75％，大幅度降低生产成本；二是有效弱化因iptg毒性带来的不利影响，为中性蛋白酶制剂在饲料或食品添加剂的应用提供了基础。