一种文库污染检测试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及核酸样本检测领域，特别涉及一种文库污染检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、随着生物技术的高速发展，人们已经充分认识到核酸是关键的遗传物质，因此以检测核酸突变为目的的检测方法层出不穷，并且广泛的应用于生命科学检测的各个领域，包括单核苷酸多态性（snp），hla，疾病的诊断与预测等，针对不同的检测目的，存在着多种多样的检测方法，而不同的检测方法之间其检测性能存在一定的差异。

2、目前常用的snp分型技术主要为基于荧光定量pcr的snp分型技术、基于探针捕获的snp分型技术、基于飞行质谱的snp分型技术等；不同snp分型技术的检测性能存在差异。1）基于荧光定量pcr的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计荧光引物，通过荧光信号产生的曲线，完成snp分型进而对实验过程中污染物的状态进行确定，该实验方法检测的灵敏度较高，但是由于该实验方法本身的局限性，无法对10个以上的snp位点同时进行检测，超过10个需分管进行检测，实验成本及周期均不可控，影响该技术在临床上的应用；2）基于荧光定量pcr的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计荧光引物，通过荧光信号产生的曲线，完成snp分型进而对实验过程中污染物的状态进行确定，该实验方法检测的灵敏度较高，但是由于该实验方法本身的局限性，无法对10个以上的snp位点同时进行检测，超过10个需分管进行检测，实验成本及周期均不可控，影响该技术在临床上的应用；3）基于探针捕获的snp分型技术，该技术对特定的snp位点设计捕获探针，探针设计完成之后混合为捕获panel，通过建库，杂交捕获，扩增，测序等实验环节对样本进行检测，该实验方法可对多个snp位点（大于100个）同时进行检测，但是由于实验过程环节较多，故存在检测周期长，成本高的问题，影响该技术在临床上的应用。目前，亟待开发一种省时、省力、低成本、准确性相对较高，可在实验室现有的条件下应用的样本交叉污染检测方法。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种文库污染检测试剂盒及检测方法。

2、鉴于现有技术中的这些问题，为了缩短检测流程提高检测效率，节省检测成本，增加检测结果的准确性，本方法直接以文库为模板使用多重不对称pcr的实验方式对不同的snp区域进行扩增，优化实验过程中文库构建及目标区域捕获等试验环节，大大提高了实验效率；同时多重不对称pcr的扩增技术中，只有一条特异性扩增引物，以及一条通用扩增引物在反应体系中参与实验，因此目的区域的产物的产量呈现线性增长，与传统的多重pcr相比在扩增的均一性上表现更加优异。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、本发明是关于一以分子检测平台生产的文库为模板，然后通过多重不对称pcr扩增直接获得多种带标记的基因标志物；基因标志物通过二代测序获得相应的snp位点信息，通过对特异性snp位点的分析实现对实验中的样本交叉污染比例进行鉴定的技术。

5、本发明的多重不对称pcr扩增体系中包含多条扩增引物，其中通过调节上游特异性引物和下游通用引物保持不同的投入比例来实现同时扩增多个目标基因，且得到的目标基因产物为线性增长。特别地，对上游特异性引物的5’端进行生物素（biotin）修饰，使得到的单链目标基因能与相应的链霉亲和素（streptavidin，简称sa）修饰的磁珠形成“biotin-sa”结合，可进一步对目标扩增区域进行富集。

6、本发明的多重不对称pcr通过抗抑制剂的dna聚合酶，以构建好的文库为扩增模板，将多个上游特异性引物按照等摩尔进行混合组成的上游引物池与下游通用引物和dntp等集中在一个反应槽，通过温度控制实现直接pcr。其中，所述pcr反应体系和反应条件如表2和表3所示。

7、本发明的多重不对称pcr，通过多个上游特异性引物按照等摩尔进行混合组成的上游引物池与下游通用引物对待检测生物样本的文库产物进行pcr扩增。特别地，所需目标基因单链由上游特异性引物延伸所得，上游特异性引物的添加量与下游通用引物的添加量需调整为合适的比例，使得目标区域的pcr产物为单链dna，其中上游特异性引物与下游通用引物的比例为1：10-1：100；优选为1：50。

8、本发明提供的检测方法包括：模板文库到目标基因扩增的过程，和目的区域二次富集的过程（具体参见图5）。

9、具体来说，本发明如下所述：

10、本发明的第一方面，提供了一种多重不对称pcr联用链霉亲和素磁珠捕获并对目标基因的snp位点进行验证的方法，所述方法包括以下步骤：

11、（1）获取待检测生物样本的文库产物；

12、（2）通过多重不对称pcr扩增获得带标记的单链基因标志物；

13、（3）对单链基因标志物进行杂交实验，实现目标区域的富集；

14、（4）经过普通pcr扩增补齐完整文库结构，获得目标文库；

15、（5）将目标文库进行二代测序。

16、在本发明第一方面所述方法中，所述步骤（1）的具体操作如下：将待检测生物样本的基因组dna完成文库构建，具体操作步骤参考诺唯赞dna文库构建试剂盒说明书，文库产物作为步骤（2）中多重不对称pcr扩增的模板；所述文库质量标准为文库生产平台标准；具体为华大t7测序平台标准。

17、优选的，所述生物样本来源于哺乳动物、植物、和微生物的至少一种。

18、优选的，所述哺乳动物为人和小鼠中的至少一种。

19、优选的，所述基因组dna为人类全血基因组dna。

20、在本发明第一方面所述方法中，所述步骤（2）的具体操作如下：将步骤（1）中经过预处理好的文库样本、hifi hot start mix、带有标记物的上游引物、下游引物，进行多重不对称pcr扩增。

21、优选的，所述hifi hot start mix包含dna聚合酶，mgcl2，dntp。

22、优选的，所述上游引物中带有的标记物为生物素，所述pcr缓冲液中mgcl2和dntp的浓度分别为1-4mm（进一步为1.5mm）和0.1-0.3mm（进一步为0.2 mm）。在一些具体的实施方式中，上文所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的摩尔浓度比为1：10-1：100；优选为1：50-1：100；进一步优选的，所述带有标记物的上游引物与所述下游引物的摩尔浓度比为1：50。

23、在本发明第一方面所述方法中，所述步骤（3）的具体操作如下：将步骤（2）中扩增得到的带标记的单链基因标志物与链霉亲和素磁珠进行杂交，杂交结束后洗去未结合的dna片段，将目标扩增区域进一步纯化。

24、优选的，所述杂交温度为65℃，所述杂交时间为45min。

25、在本发明第一方面所述方法中，所述步骤（4）的具体操作如下：将步骤（3）中富集产物进行普通pcr扩增补齐完整文库结构，并进一步纯化，获得目标文库。

26、在本发明第一方面所述方法中，所述步骤（5）的具体操作如下：将步骤（4）中的目标文库选取合适的测序平台进行上机测序；优选的，所述测序平台为mgi-t7测序平台。

27、本发明还提供一种文库构建的试剂盒，该试剂盒中包含扩增引物。

28、所述扩增引物包含上游引物、下游引物，所提到的上游引物含有与扩增模板相同的序列（优选的，上游引物含有部分文库接头序列+特异性扩增目标snp的序列），下游引物含有与扩增模板反向互补序列（优选的，下游引物含有文库接头序列），序列的碱基顺序与mgi建库接头序列一致。

29、不同的上游引物溶解于相同的溶剂中，按照等摩尔进行混合组成多重不对称pcr上游引物池，与下游引物，pcr反应试剂形成一套检测试剂盒。

30、所述多重不对称pcr第一轮扩增上游引物在实际设计过程中需遵循以下原则；

31、1.用于多重不对称pcr的多个目标dna序列的上游引物池，所述上游引物池内仅仅包括针对每个目标snp上下游序列所设计的正向扩增引物，即上游引物；

32、其中：a）每条所述上游引物用于扩增snp区域的特异性上游引物序列之间需尽可能满足如下条件：1）每个所述特异性上游引物序列与目标序列之外的序列不发生扩增；2）所述特异性上游引物序列之间不形成二聚体；3）所述特异性上游引物序列之间不形成发夹结构；

33、b）在所述特异性上游引物序列的5’端连接有与基因组不同源的通用序列，该序列为文库接头序列的一部分；

34、c）在所述用于特异性扩增的反向引物，即下游引物，其序列为固定序列，为文库接头的相同序列；

35、d）不同上游引物之间tm差值≤5℃；

36、2 .所述上游引物池中的不同特异性上游引物序列之间还需满足以下要求：

37、1）如上游引物无法满足每个所述特异上游引物序列与目标序列之外的序列不发生扩增，则特异性上游引物序列与目标区域的tm与非目标区域的tm的差值≥10℃，优选≥15℃；2）如上游引物无法满足特异性上游引物序列之间不形成二聚体，则所述特异性上游引物序列与目标区域的tm和其他特异性上游引物序列形成二聚体的tm的差值≥5℃，优选≥10℃；3）如上游引物无法满足特异性上游引物序列之间不形成发夹结构，则所述特异性上游引物序列与目标区域的tm和形成发卡结构的tm的差值≥5℃，优选≥10℃，优选的tm值基于santalucia 2007热力学参数表的最邻近法计算。

38、所述多重不对称pcr上游引物在混合过程中需遵循以下原则，所有引物混合后终浓度相同，各引物浓度≤4µm；进一步的，各引物浓度为50nm-4µm。

39、所述多重不对称pcr上游引物在设计过程中添加修饰，所有上游引物5’端添加biotin修饰。

40、所述多重不对称pcr上游引物与下游引物需按照一定配比进行反应，其中上游引物：下游引物比例≥1：100；进一步为1：10-1：100；更进一步为1：50。

41、本发明采用半巢式pcr原理设计，在整个实验过程中只需进行2步pcr，即可形成目标文库。覆盖20个snp位点，且每例文库实验成本约40元，建库成本较低。

42、在实施过程中，方案所提及的snp位点类型种类不受限制，可根据实验不同的应用场景及目的，对snp进行替换。

43、在实施过程中，方案所提及的snp位点数目至少为1个，优选为≤500个，进一步为≤50个，本方案中为20个位点。

44、优选的，所述的snp位点包括如下位点等中的至少一种：rs1032807，rs1105176，rs1805034，rs753381，rs1392265，rs12828016，rs171953，rs156318，rs70156，rs1071583，rs104894965，rs4621，rs4981088，rs7169981，rs2230267，rs1515002，rs156697，rs1395936，rs1541290，rs11096959。

45、在方案实施过程中，上游引物特异性区域长度为18-30nt（优选为18-22nt），与文库接头部分相同的序列长度为20-30nt（优选为25nt）。

46、在方案实施过程中，与文库接头部分相同的序列位于上游引物的5’端。

47、在方案实施过程中，位于上游引物的5’端部分的接头序列含有如下碱基序列gaacgacatggctacgatccgactt。

48、在方案实施过程中，位于上游引物的5’端第一个碱基添加biotin修饰。

49、在方案实施过程中，根据20个snp位点设计的上游引物如表1所示。

50、在方案实施过程中，下游引物长度为17-30nt（优选为17nt），其序列固定，文库接头序列的部分反向互补序列。

51、在方案实施过程中，下游引物为固定序列含有如下碱基序列tgtgagccaaggagttg。

52、在该实施方案过程中，多重不对称pcr通过抗抑制剂的dna聚合酶进行扩增反应，具体为使用为kapa hifi扩增酶mix。

53、使用上述试剂盒开发一种文库构建方法，包括如下步骤：

54、第一轮扩增步骤，以待检测生物样本的文库产物为模板，利用上述试剂盒中上游引物池与下游引物进行多重不对称pcr扩增，获得第一轮扩增产物；扩增产物经纯化后进行链霉亲和素磁珠捕获获得目标区域片段，经过普通pcr扩增补齐完整文库结构，获得目标文库进行上机测序。

55、在实施方案中，第一轮扩增步骤中，还包括对第一轮扩增产物进行纯化，得到纯化后的扩增产物，然后进行目标区域富集，富集后进行普通pcr扩增即得到目标文库。

56、在实施方案中，所述纯化包括但不限于磁珠纯化，切胶纯化，膜纯化。

57、在该实施方案中，只经过了两步扩增步骤即获得了目标文库，未经过末端修复、加接头反应等常规建库反应。

58、利用构建好的文库可提供一种文库污染的检测方法，包括：从所述文库构建方法构建得到的目标文库上机测序后得到的测序数据中统计snp位点的突变频率，预测文库否存在污染。

59、在实施方案中，样本污染比例计算方法如下，统计snp位点中纯合子所检测出来的最小的等位基因的频率，随后将统计出来的所有的数值取出计算出平均值为c，当c大于校准系数r时，c即为样本污染比例的最小数值，最小数值的两倍即为污染比例的最大值；当c小于校准系数r时，则证明文库中未产生交叉污染。

60、在实施方案中，纯合子所检测出来的最小的等位基因的频率（a），例如在纯合snp（a/c）位点中，该位点如果为纯合的a突变，那么该位点检测到的序列应该100%全部为a，如果检测到低频的c则证明，检测到的c为其他样本污染所导致，以此判断实验样本是否发生污染。

61、在实施方案中，由于污染源样本该位点也存在两种可能纯合子或杂合子，当污染源样本为纯合子时，那么该位点检测到的最小的等位基因的频率即为样本污染比例，当污染源样本为杂合子时，那么该位点检测到的最小的等位基因的频率的两倍即为样本污染比例，因此在不确定污染源自身snp的状态时，其污染比例的最大值为纯合子所检测出来的最小的等位基因的频率的两倍。

62、在实施方案中，为了确保检测结果的准确性，需对多重不对称pcr反应体系中检测到的所有的纯合子所检测出来的最小的等位基因的频率分别进行计算污染比例，最终将所有的结果进行统计计算出平均值（c），即为污染源样本的污染比例。

63、在实施方案中，校准系数（r），在正常的实验过程中由于pcr扩增实验，以及二代测序过程中均会存在一定错误率，该错误率非样本污染导致，而是由于实验自身局限性产生，这部分非样本污染产生的错误率即为校准系数。

64、在实施方案中污染率计算流程为 污染率=[c，2c]，且需要满足c＞r。

65、所述检测方法可准确检出污染比例在≥3%的外来污染物的污染情况；进一步，可准确检出污染比例在3%-10%的外来污染物的污染情况。

66、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

67、本发明提供的基于snp的多重不对称pcr防污染方法可以实现简单、快速、低成本、高准确性的检测，是一种污染排查的有效方法。