一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基及培养方法

本发明涉及植物花粉离体培养，更具体地，本发明涉及一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基及培养方法。

背景技术：

1、油茶是山茶科山茶属常绿小乔木，是我国特有油料经济作物之一，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本油料植物。油茶属于典型的异花授粉自交不亲和植物。授粉受精不良、座果率低等原因导致其单株产果率差异大、大小年明显等低产低效现象，已成为油茶产业发展的瓶颈问题。杂交育种是繁殖后代及选育新品种的主要方法。远缘杂交能有效综合双亲优势，实现油茶品种改良，但容易受到生殖隔离的限制。

2、以广东本土广宁红花油茶与高州油茶杂交为例，利用现有的人工授粉技术让广宁红花油茶(父本)与高州油茶(母本)进行种间杂交，只有很少的果实。特别是落在柱头上的花粉萌发和花粉管在雌蕊组织中的生长是确保成功受精的前提。油茶花粉萌发培养为油茶杂交、人工辅助授粉提供生命力较强的花粉，同时也为大批量植株花粉萌发活力以及育性的快速鉴定提供了一种有效途径。

3、目前实验室常用的油茶发粉萌发活力检测主要包括ttc染色液染色法检测和琼脂固体培养基培养法两种方法，前者准确率低，严重制约人工授粉成功率。琼脂固体培养基培养法是将融化的琼脂培养基铺在载玻片上，待琼脂凝固冷却后接种花粉，放在培养皿中后于培养箱中培养。琼脂固体培养基培养法的前期琼脂培养基的配制及铺片繁琐费时，均匀平铺点样花粉不容易操作，为保证培养湿度需在平皿等容器中培养，花粉萌发培养时间长达至少10小时以上，花粉萌发率低。油茶花粉的液体培养特性关系到油茶人工授粉技术的研发与应用，然而关于油茶花粉液体培养方面的研究却极少，只有越南油茶和陆川油茶采用液体培养基萌发法，但均需要调整ph值，操作较复杂，且花粉萌发培养时间仍长于6小时。

4、因此，迫切需要找到一种能操作简单、省时省力、效果又好的油茶花粉离体萌发和花粉培养的液体培养基及其培养方法，以在较短时间下提高油茶花粉的离体培养萌发率和离体花粉管长度。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基及培养方法。解决琼脂糖固体培养操作繁琐、花粉培养时间长、花粉萌发率低等技术问题。通过改善油茶花粉快速离体萌发和花粉管生长的液体培养基条件，提供的液体培养基的组分简单、制作时无需调节ph值。本发明所要解决的另一技术问题在于提供利用前述液体培养基高效快速、操作简单进行油茶花粉离体萌发和花粉管萌生长的培养的方法。

2、根据本发明的一个方面，提供了一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基，包括以下含量的组分：0.005％～0.015％硼酸、10％～20％蔗糖和0.02％～0.04％ca(no3)2·4h2o，余量以水补足。

3、在一些实施方式中，一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基，包括以下含量的组分：0.01％硼酸、15％蔗糖和0.03％ ca(no3)2·4h2o，余量以水补足。

4、在一些实施方式中，液体培养基的配制方法为：液体培养基的配制方法为：将硼酸和ca(no3)2·4h2o按照质量分数配制成母液，母液中含有质量分数为1％的硼酸和3％ca(no3)2·4h2o，将母液长期贮藏于4℃冰箱内；使用时，取1ml母液加入15克蔗糖和84ml水，即可得到包含质量分数0.01％硼酸、15％蔗糖和0.03％ ca(no3)2·4h2o的液体培养基。

5、根据本发明的另一个方面，提供了一种用于油茶花粉离体萌发的培养方法，包括以下步骤：

6、s1.将油茶花蕾插于装有清水的瓶中，将处于开花时期的花药取下，置于硫酸纸袋内，自然散粉或镊子解剖花药，收集得到花粉备用；

7、s2.取液体培养基，通过玻璃棒滴到凹玻片的凹槽内，用镊子将步骤s1中收集的花粉均匀撒播于液体培养基中；

8、s3.将上述装有液体培养基和花粉的凹玻片置于底部装有蒸馏水的暗盒中，暗盒底部注入3-5毫米深的水，凹玻片放置于中部玻片架空层上，盖上盒盖；

9、s4.将上述暗盒放置于培养箱或培养室内进行暗培养；

10、s5.镜检，观察统计花粉萌发率和花粉管生长情况，花粉萌发率和花粉管长度分别按照以下公式计算：

11、花粉萌发率＝(花粉萌发数/花粉总数)×100％；

12、花粉管长度计数单位：1d(diameter)＝1倍的花粉粒直径。

13、在一些实施方式中，步骤s4中暗培养的温度为25℃。

14、在一些实施方式中，步骤s4中暗培养的时间为1～2小时。

15、在一些实施方式中，步骤s5中镜检的具体操作为：使用显微镜进行监测花粉萌发并拍照，随机选取每个处理随机选取5个镜头拍照，视野内花粉粒的数量须大于50粒，进行观察统计花粉萌发率和花粉管生长情况，当观察到花粉管的长度大于其直径时即为萌发；每个重复统计最长的10个花粉管长度。

16、根据本发明的再一个方面，提供了一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基在油茶花粉活力测定中的应用。

17、本发明的有益效果：

18、1、本发明的液体培养基组分简单，只含有蔗糖、硼酸、及ca(no3)·4h2o，且无需调节培养基的ph值，成本低，价格便宜；

19、2、首次使用提前配置培养基母液的方式，母液可长期贮藏于4℃冰箱中，使用时只需取微量母液添加蔗糖和水稀释即可得液体培养基，培养基随用随配，操作简单易行，省时省力，不浪费，误差小；

20、3、暗盒替代遮光和保湿的培养箱，既能遮光又能保湿，培养条件及方式易于控制；方便在田间直接进行取样培养，便于批量测定油茶植株的花粉萌发活力和花粉管生长培养，在进行大量的花粉萌发培养具有较优的综合效果；

21、4、本发明解决了琼脂固体基培养法中前期琼脂培养基的配制、铺片繁琐费时、均匀平铺点样花粉不容易操作，后续培养箱恒温避光保湿培养费力的技术问题；本发明通过液体薄层培养结合暗盒培养的方法，可将培养时间由原来的10小时缩短为1-2小时，花粉萌发率高，花粉管生长快，大大提高了花粉萌发的培养效率；

22、5、本发明的液体培养基和培养方法能够高效快速促进油茶花粉的萌发和花粉管的快速生长，进而促进油茶的座果和果实发育，在油茶杂交育种生产中具有广泛的应用前景。

技术特征：

1.一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基，其特征在于，包括以下含量的组分：0.005％～0.015％硼酸、10％～20％蔗糖和0.02％～0.04％ca(no3)2·4h2o，余量以水补足。

2.根据权利要求1所述的一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基，其特征在于，包含以下含量的组分：0.01％硼酸、15％蔗糖和0.03％ca(no3)2·4h2o，余量以水补足。

3.根据权利要求2所述的一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基，其特征在于，所述液体培养基的配制方法为：将硼酸和ca(no3)2·4h2o按照质量分数配制成母液，母液中含有质量分数为1％的硼酸和3％ca(no3)2·4h2o，将母液长期贮藏于4℃冰箱内；使用时，取1ml母液加入15克蔗糖和84ml水，即可得到包含质量分数0.01％硼酸、15％蔗糖和0.03％ca(no3)2·4h2o的液体培养基。

4.一种用于油茶花粉离体萌发的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤s4中暗培养的温度为25℃。

6.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤s4中暗培养的时间为1～2小时。

7.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述步骤s5中镜检的具体操作为：使用显微镜进行监测花粉萌发并拍照，随机选取每个处理随机选取5个镜头拍照，视野内花粉粒的数量须大于50粒，进行观察统计花粉萌发率和花粉管生长情况，当观察到花粉管的长度大于其直径时即为萌发；每个重复统计最长的10个花粉管长度。

8.权利要求1-2任一项所述的一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基在油茶花粉活力测定中的应用。

技术总结
本发明公开了一种用于油茶花粉离体萌发的液体培养基及培养方法，包括以下含量的组分：0.005％～0.015％硼酸、10％～20％蔗糖和0.02％～0.04％Ca(NO<subgt;3</subgt;)<subgt;2</subgt;·4H<subgt;2</subgt;O，余量以水补足。步骤：S1.将油茶处于开花时期的花药取下，收集得到花粉备用；S2.将步骤S1中收集的花粉均匀撒播于液体培养基中；S3.将上述装有液体培养基和花粉的凹玻片置于底部装有蒸馏水的暗盒中盖上盒盖；S4.进行暗培养；S5.镜检，观察统计花粉萌发率和花粉管生长情况。本发明的液体培养基和培养方法能够高效促进油茶花粉萌发和花粉管生长，进而促进油茶的座果和果实发育，在油茶杂交育种生产中具有广泛的应用前景。

技术研发人员：阳桂芳,张金云,杨光,刘姚,赵秀娟,张方秋,宋杰,吴世军,林秀灵
受保护的技术使用者：广东生态工程职业学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21