一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法及应用与流程

本发明涉及分子生物学，尤其涉及一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法及应用。

背景技术：

1、数字pcr是近十年来兴起的第三代pcr技术，包括微腔室数字pcr(cdpcr)和微液滴数字pcr(ddpcr)，通过将反应体系分割到成千上万个微反应单元中，使得每个反应单元不包含或包含目标分子，然后进行扩增使有无包含目标分子的微反应单元产生可检测的信号差别，分别计数对应微反应单元数目或比例，最后根据泊松分布原理即可推算出靶分子的原始拷贝数或浓度。与荧光pcr法相比，数字pcr法具有精准、超灵敏度和不易受抑制物影响等优点，使得其能够有效检测临床样本中低载量的病毒核酸，降低假阴性结果。

2、数字pcr利用热循环扩增技术对目标分子进行扩增，微反应单元易受热循环影响而增加了体系的不稳定性，同时基于pcr的核酸扩增方法对场地及操作人员要求较高，难以满足当前疾病防控对现场检测和面向家庭使用的迫切需求。等温扩增技术不同于pcr方法，其不依赖热循环仪，可在恒温条件下对目标分子进行高效扩增。等温扩增技术主要包括重组酶聚合酶扩增(rpa)、依赖核酸序列的扩增技术(nasba)、解旋酶依赖型扩增(hda)、链置换扩增(sda)、滚环扩增(rca)、环介导等温扩增(lamp)、交叉引物扩增(cpa)等。数字等温扩增技术综合微反应单元分割技术与等温扩增技术优点，可在恒温条件下对目标分子进行超灵敏检测，准确度高、稳定性好。

3、目前数字等温扩增方法主要为数字环介导等温扩增技术，lamp通过2-3对引物在60-65摄氏度下对目标dna进行特异性扩增，具有快速、高特异性、设备要求简单等优点。环介导等温扩增产物检测方法有琼脂糖凝胶电泳法、焦磷酸镁浊度检测、sybr green染色法和钙黄绿素检测法，琼脂糖凝胶电泳法操作繁琐且易造成污染，焦磷酸镁浊度检测特异性低，sybr green染色法和钙黄绿素检测法需引入与双链结合的染料导致聚合酶反应活性降低。为克服上述检测方法的缺陷，实现环介导等温扩增产物的闭盖及特异性检测，亟需开发出一种灵敏度高、特异性好，且能同时检测多个靶标的数字环介导等温扩增方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种灵敏度高、特异性好，且能同时检测多个靶标的基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法及应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：一方面，本发明提供了一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，包括以下步骤：

3、s1，引物、探针设计，所述引物包括：正向外引物f3和反向外引物r3，正向内引物fip和反向内引物bip，环引物lb；

4、探针为双链探针lfp，所述双链探针lfp包括两条部分互补的序列，第一条序列lf1为lf与f1c片段的嵌合体，第二条序列lf2为与f1c片段互补的f1，lf1和lf2混合后通过退火杂交制备成双链探针lfp；

5、s2，制备含有步骤s1的引物和探针的环介导等温扩增反应体系，加入油相，注入微流控芯片生成单分散的液滴，然后将液体转入反应管扩增。

6、在以上技术方案的基础上，优选的，所述第一条序列lf1的5’端修饰有淬灭基团，所述第二条序列lf2的3’端修饰有荧光基团。

7、在以上技术方案的基础上，优选的，所述淬灭基团选自dabcyl或bhq1，所述荧光基团选自fam、rox、hex中的一种。

8、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s1中所述双链探针lfp制备方法为：将10×isothermal amplification buffer、lf1和lf2混合后，于90-95℃孵育5-10min，然后缓慢退火至25-30℃得到双链探针。

9、在以上技术方案的基础上，优选的，步骤s2中扩增程序为：60-65℃恒温扩增50-60min，扩增结束后95-98℃反应10-15min。

10、在以上技术方案的基础上，优选的，所述环介导等温扩增反应体系中正向外引物f3和反向外引物r3的浓度为0.1-0.3μm。

11、在以上技术方案的基础上，优选的，所述环介导等温扩增反应体系中正向内引物fip和反向内引物bip的浓度为1.4-1.8μm，环引物lb的浓度为0.3-0.5μm。

12、在以上技术方案的基础上，优选的，所述环介导等温扩增反应体系中双链探针lfp的浓度为0.3-0.5μm。

13、另一方面，本发明还提供了一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法在检测sars-cov-2病毒n和orf1ab基因中的应用。

14、一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法在检测sars-cov-2病毒n和orf1ab基因中的应用，所述n基因的正向外引物f3和反向外引物r3的序列如seq id no.1和seq id no.2，所述n基因的正向内引物fip和反向内引物bip的序列如seq id no.3和seqid no.4，所述n基因的环引物lb的序列如seq id no.5，所述n基因的双链探针lfp的lf1和lf2的序列如seq id no.6-7；

15、所述orf1ab基因的正向外引物f3和反向外引物r3的序列如seq id no.8和seq idno.9，所述orf1ab基因的正向内引物fip和反向内引物bip的序列如seq id no.10和seq idno.11，所述orf1ab基因的环引物lb的序列如seq id no.12，所述orf1ab基因的双链探针lfp的lf1和lf2的序列如seq id no.13-14。

16、本发明的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法及应用相对于现有技术具有以下有益效果：

17、(1)本发明的双链探针lfp在环介导等温扩增中将生成形如结构1的产物，结构1通过3’端形成茎环结构进行延伸，形成结构2产物，同时将修饰有荧光基团的f1序列置换而产生荧光。结构2中的茎环结构经bip杂交并延伸，形成结构3，由于lfp引入了f1c片段使得末端能形成茎环结构(虚框处)，使得结构3自身能继续延伸、置换生成更多的产物，同时自身茎环亦能供lfp杂交、延伸并形成更多茎环结构从而引发更多反应，提高反应效率，上述过程在常规的lf引物情况下是不能发生的。此外，若lfp 5’端为非f1c序列，则结构3自身不能继续延伸，导致杂交上的lfp双链不能被置换分离，影响最终荧光信号。综上，本发明双链探针同时实现了信号的生成及反应效率的提高。

18、(2)采用的双链探针较分子信标、蝎形探针及脚手架探针结构简单，降低了探针的设计难度及试剂成本。

19、(3)本发明实现了基于荧光探针的数字环介导等温扩增技术，降低了常规数字pcr对设备的要求及显著降低了反应时间，提高了常规环介导等温扩增方法灵敏度且能同时检测多个靶标。而且本方法特异性强，且不受抑制物的影响，适用于检测基质成分复杂的样本。

技术特征：

1.一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：所述第一条序列lf1的5’端修饰有淬灭基团，所述第二条序列lf2的3’端修饰有荧光基团。

3.如权利要求2所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：所述淬灭基团选自dabcyl或bhq1，所述荧光基团选自fam、rox、hex中的一种。

4.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：步骤s1中所述双链探针lfp制备方法为：将10×isothermal amplification buffer、lf1和lf2混合后，于90-95℃孵育5-10min，然后缓慢退火至25-30℃得到双链探针。

5.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：步骤s2中扩增程序为：60-65℃恒温扩增50-60min，扩增结束后95-98℃反应10-15min。

6.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应体系中正向外引物f3和反向外引物r3的浓度为0.1-0.3μm。

7.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应体系中正向内引物fip和反向内引物bip的浓度为1.4-1.8μm，环引物lb的浓度为0.3-0.5μm。

8.如权利要求1所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法，其特征在于：所述环介导等温扩增反应体系中双链探针lfp的浓度为0.3-0.5μm。

9.如权利要求1-8任一项所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法在检测sars-cov-2病毒n和orf1ab基因中的应用。

10.如权利要求9所述的一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法在检测sars-cov-2病毒n和orf1ab基因中的应用，其特征在于：

技术总结
本发明提出了一种基于双链荧光探针的数字环介导等温扩增方法及应用，方法包括以下步骤：S1，引物、探针设计，所述探针为双链探针LFP，所述双链探针LFP包括两条部分互补的序列，第一条序列LF1为LF与F1c片段的嵌合体，第二条序列LF2为与F1c片段互补的F1，LF1和LF2混合后通过退火杂交制备成双链探针LFP；S2，制备含有步骤S1的引物和探针的环介导等温扩增反应体系，加入油相，注入微流控芯片生成单分散的液滴，然后将液体转入反应管扩增。本发明实现了基于荧光探针的数字环介导等温扩增技术，具有灵敏度高、特异性好，且能同时检测多个靶标的优点。

技术研发人员：黄思强,秦文星,李旻,齐利芬,秦雨琴,田丽萍
受保护的技术使用者：武汉康昕瑞基因健康科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/3/12