一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法

(一)本发明涉及一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、豆血红蛋白(leghemoglobin,legh)是一类在与根瘤菌共生的植物结节根部中发现的植物源血红蛋白，在植物蛋白肉加工中可作为重要的风味催化剂和着色剂，大大增加植物蛋白肉的拟真性。豆血红蛋白由一个血红素和一条肽链组成，经分级提取可以得到两个主要成分和两个次要成分。研究发现，豆血红蛋白的结构和基因序列与牛珠蛋白相似，以豆血红蛋白作为色素添加剂，在赋予植物肉类似牛肉的颜色质地的同时，还具有较高的营养价值。血红素是铁卟啉化合物，机体中约有70％的铁以血红素的形式存在，且血红素作为合成胆红素的必备前体，是制备人工牛黄的重要原料。随着人们对血红蛋白功效的深入研究，血红素和血红蛋白肽作为一种良好的补铁剂已被广泛应用于功能性食品中。

2、现已实现豆血红蛋白在毕赤酵母中的诱导分泌表达，但毕赤酵母诱导中需要甲醇，用于食品中的安全性降低，相比毕赤酵母，酿酒酵母安全性高，是食品级安全性真菌，美国食品及药物管理局(fda)和欧洲药品管理局(emea)批准的重组疗法需要的来源于真核细胞微生物的蛋白几乎完全是由酿酒酵母产生的。酿酒酵母是传统的生物技术模式生物，也是第一个完成全部基因组测序的真核生物，是种典型的真核细胞模型和重要的模式生物，可表达各种原核和真核来源的蛋白。酿酒酵母广泛地用于食品工业，具有安全无毒，对氧气的需求低，遗传背景清楚，操作简单等优点。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法，选择质粒pyes2-ct为表达载体，食品级微生物酿酒酵母by4741为表达菌株实现豆血红蛋白的高效表达。pyes2-ct表达载体为gal1启动子，能够在酿酒酵母中被半乳糖高水平诱导蛋白表达目的蛋白，且多克隆位点可以使用的很多限制酶切位点，便于基因插入。pyes2-ct与α-factor可以更好的融合，为以后实现豆血红蛋白在酿酒酵母中的胞外分泌做铺垫，解决了豆血红蛋白在食品级微生物中表达并实现在发酵罐中高密度发酵。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法，所述方法为：将豆血红蛋白编码基因连接至质粒pyes2-ct中，采用醋酸锂转化法转化食品级微生物，筛选阳性转化体，接种至ypd液体培养基，在25℃～28℃、150～250rpm条件下进行摇瓶发酵培养至od600为1-2，此时菌体将培养基中葡萄糖消耗尽，加入终浓度10-30g/l(优选20g/l)的半乳糖作为诱导剂，25℃～28℃，150～250r/min诱导培养，获得含酿酒酵母胞内高效表达豆血红蛋白的发酵液，实现豆血红蛋白在食品级微生物中的高效表达；所述食品级微生物包括酿酒酵母by4741；所述ypd液体培养基组成：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物20g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。

4、优选的，所述豆血红蛋白氨基酸序列如seq id no.1所示，编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、优选的，所述酿酒酵母by4741购自上海集奇生物科技有限公司。

6、优选的，所述豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法为：将含豆血红蛋白的食品级微生物接种至ypd平板上，恒温培养箱28℃培养2-3d，挑取单菌落接种至ypd液体培养基，在25℃～28℃、150～250rpm条件下进行摇瓶发酵至od600为0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度5-15％(优选10％)的接种量接种至装有ypd液体培养基的发酵罐中，控制发酵罐温度28℃，初始通气量为0.5l/min，转速为250-950rpm，溶氧为20-40％，当ph大于5.5且do值大于40％时，向发酵罐中以每分钟2ml的速度添加半乳糖水溶液，继续发酵培养12-24h，获得胞内高效表达豆血红蛋白的发酵液。

7、优选的，所述半乳糖水溶液浓度为500g/l，添加量以初始发酵罐中ypd液体培养基体积计为300ml/2l。

8、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

9、本发明提供了一种豆血红蛋白能够稳定遗传并在食品级微生物特别是酿酒酵母中高效表达的方法，在实现豆血红蛋白异源高效表达的同时，也解决了现有用于豆血红蛋白表达的宿主限制问题，豆血红蛋白的产量为1.82g/l，为豆血红蛋白在食品工业中的安全生产应用提供新方法。

10、(四)具体实施方式

11、图1为实施例1重组质粒构建完成后的质粒图谱。

12、图2为实施例1重组质粒pet28a-legh的凝胶电泳图；泳道m代表marker(5000bp)，泳道1代表质粒pet28a-legh。

13、图3为实施例1重组质粒导入大肠杆菌后的菌落pcr产物的凝胶电泳图；泳道m代表marker(5000bp)，泳道1-4均代表大肠杆菌单菌落。

14、图4为实施例2重组大肠杆菌e.coli bl21-pet28a-legh超声破碎后上清液和沉淀溶解液的sds-page图；泳道1、泳道2代表破碎后上清液，泳道3、泳道4代表破碎后沉淀溶解液，泳道5代表marker。

15、图5为实施例3重组表达载体pyes2-ct-legh的质粒图谱。

16、图6为实施例3菌落pcr凝胶电泳图，泳道m代表marker(5000bp)，泳道1代表质粒pyes2-ct-legh。

17、图7为实施例4菌株pyes2-ct-legh-invc1在ypd上的生长情况。

18、图8为实施例4菌株pyes2-ct-legh-by4741在ypd上的生长情况。

19、图9为实施例4菌株pyes2-ct-legh-cen.pk2-1c在ypd上的生长情况。

20、图10为豆血红蛋白在大肠杆菌和酿酒酵母中表达量的柱状图。

21、图11为豆血红蛋白在不同酿酒酵母表达菌株中表达量的柱状图。

22、图12为实施例5步骤2诱导表达前后sds-page图。泳道m代表marker，泳道1代表未加半乳糖诱导的发酵上清液，泳道2-5均代表诱导表达后的发酵上清液。

23、图13为实施例5步骤3血红蛋白纯酶液sds-page图。泳道m代表marker，泳道1、2均代表纯酶液。

24、图14为5l发酵罐初步放大实验中od600、葡萄糖含量，豆血红蛋白浓度的数值变化。

技术特征：

1.一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法，其特征在于，所述方法为：将豆血红蛋白编码基因连接至质粒pyes2-ct中，采用醋酸锂转化法转化食品级微生物，筛选阳性转化体，接种至ypd液体培养基，在25℃～28℃、150～250rpm条件下进行摇瓶发酵培养至od600为1-2，加入终浓度10-30g/l的半乳糖作为诱导剂，25℃～28℃，150～250r/min诱导培养，获得含酿酒酵母胞内高效表达豆血红蛋白的发酵液，实现豆血红蛋白在食品级微生物中的高效表达；所述食品级微生物包括酿酒酵母by4741；所述ypd液体培养基组成：葡萄糖20g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物20g/l，溶剂为蒸馏水，ph自然。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述豆血红蛋白编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法为：将含豆血红蛋白的食品级微生物接种至ypd平板上，恒温培养箱28℃培养2-3d，挑取单菌落接种至ypd液体培养基，在25℃～28℃、150～250rpm条件下进行摇瓶发酵至od600为0.6-0.8，获得种子液；将种子液以体积浓度5-15％的接种量接种至装有ypd液体培养基的发酵罐中，控制发酵罐温度25-30℃，初始通气量为0.1-1.0l/min，转速为250-950rpm，溶氧为20-40％，当ph大于5.5且do值大于40％时，向发酵罐中以每分钟2ml的速度添加半乳糖水溶液，继续发酵培养12-24h，获得胞内高效表达豆血红蛋白的发酵液。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述半乳糖水溶液浓度为500g/l，添加量以初始发酵罐中ypd液体培养基体积计为300ml/2l。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵罐温度28℃，初始通气量为0.5l/min。

技术总结
本发明公开了一种豆血红蛋白在食品级微生物中高效表达的方法，选择质粒pYES2‑CT为表达载体，食品级微生物酿酒酵母BY4741为表达菌株实现豆血红蛋白的高效表达。本发明提供了一种豆血红蛋白能够稳定遗传并在食品级微生物特别是酿酒酵母中高效表达的方法，在实现豆血红蛋白异源高效表达的同时，也解决了现有用于豆血红蛋白表达的宿主限制问题，豆血红蛋白的产量为1.82g/L，为豆血红蛋白在食品工业中的安全生产应用提供新方法。

技术研发人员：胡晴,杨胜利,张慧,肖功年,孙培龙
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/11