水稻蛋白激酶OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用

本发明属于植物生物工程和转基因，涉及水稻蛋白激酶ossapk5在盐胁迫下提高水稻种子萌发能力和幼苗抗盐能力中的应用，专用于水稻抗盐品种选育和盐胁迫下水稻遗传改良。

背景技术：

1、水稻是世界上最重要的粮食作物之一，盐胁迫是水稻生长过程中最易遭遇的非生物胁迫之一(lutts等，1995)，因此培育具有抗盐性的水稻品种，对于缓解因耕地的盐渍化造成的粮食危机具有重要的意义。

2、过高的盐离子会对水稻造成离子胁迫和渗透胁迫，这两种胁迫又都可影响水稻植株体内活性氧代谢系统的平衡，进而产生氧化胁迫，使膜脂和膜蛋白过氧化，导致膜的完整性被破坏、膜渗透性增加等，影响水稻植株的多种生理生化代谢途径，包括光合作用、呼吸作用、水分平衡、氧化平衡、离子平衡等，严重时抑制植株正常生长，甚至导致植物体死亡(deinlein et al.,2014)。

3、在盐胁迫下，蛋白质磷酸化级联反应被激活并发挥关键作用在水稻耐盐性中的作用。水稻中的渗透胁迫/aba活化蛋白激酶(osmotic stress/aba–activated proteinkinases，sapks)共有10个家族成员(sapk1-10)(kobayashi,2004)。现有技术中未报道关于水稻ossapk5参与响应盐胁迫调控方面的功能和应用。

技术实现思路

1、本发明以水稻ossapk5为切入点，克隆基因ossapk5，进一步通过荧光定量pcr分析、亚细胞定位、生长表型分析等技术对该基因的表达谱和基因功能进行了分析，旨在进一步解析水稻耐盐机理并为后期耐盐品种培育提供候选基因，为今后水稻作物改良提供技术依据。

2、本发明提供了水稻蛋白激酶基因ossapk5在提高水稻抗盐能力中的应用，所述ossapk5基因的编号为loc_os04g59450，该基因的全基因序列如seq id no:1所示，cdna序列如seq id no:2所示，启动子区序列如seq id no:3所示。

3、所述ossapk5基因编码的蛋白为snrk2家族蛋白激酶，由371个氨基酸组成，其氨基酸序列如seq id no:4所示。

4、本发明通过rna反转录的方法获得ossapk5的cdna序列，然后将ossapk5基因的cdna连接到p30-gfp，获得ossapk5基因的和gfp融合蛋白载体35s-sapk5-gfp，然后将ossapk5的启动子区序列连接到p1300上，获得gus分析载体prosapk5:gus。

5、本发明利用crispr/cas9基因编辑技术，在水稻粳稻品种日本晴(oryza.satival.spp.japonica,var nipponbare,aa genome)中敲除ossapk5基因，制备得到ossapk5基因敲除的植株s5-1和s5-2，比较了野生型种子和s5-1、s5-2突变体种子在添加不同浓度nacl(0和175mm)的ms板上的种子萌发率，以胚芽鞘长度>5mm作为萌发已完成的标准，将萌发3天的幼苗转移至含有175mm nacl的ms培养瓶中生长7天，统计突变体和野生型植株生长表型。

6、本发明ossapk5基因在水稻苗期盐胁迫抗性中的探究，通过将野生型和和s5-1、s5-2突变体种子分别置于培养皿中萌发，待水稻种子生长到2～3cm时，将野生型和突变体幼苗转移至全培养液中培养，每盆中野生型水稻与突变型水稻数量各16株，将水培4周龄的不同基因型的植株移至添加了175mm nacl的ms培养液中处理5天后，再移至新鲜的ms培养液中回复7天，统计突变体和野生型植株的存活率、株高、干重等生长表型，分析渗透调节物质和抗氧化物质等含量变化。

7、本发明的有益效果：

8、(1)本发明通过在水稻原生质体中的亚细胞定位明确，ossapk5基因在细胞质和细胞核中均有表达，通过gus染色分析明确，ossapk5基因最强的表达在根，其次是在种子。

9、(2)本发明萌发期的实验表明，ossapk5基因可以有效提高盐胁迫下水稻种子萌发能力，并显著改善盐胁迫下种子萌发后幼苗的生长表型。

10、(3)本发明苗期耐盐分析表明，ossapk5基因可以在盐胁迫调节中起正调节作用，实验中，将水培4周龄的不同基因型的植株移至添加了不同浓度nacl(0，175mm)的ms培养液中处理5天后，统计s5-1和s5-2突变体和野生型植株的存活率，在0mm nacl处理5天后的生长表型，s5-1和s5-2突变体株系与野生型无明显差异，但是在175mm nacl处理5天后，s5-1和s5-2突变体株系分别为57％和61％，野生型则为79％；；在0mmnacl处理下，s5-1和s5-2突变体株系与野生型在生长表型上无明显差别，但是在175mm nacl处理后，在s5-1和s5-2突变体株系中盐胁迫引起的可见损伤比野生型更加严重，表现在与野生型相比，s5-1和s5-2突变体株系长度(地上和地下部分)和鲜重(地上和地下部分)均明显低于野生型，地上和地下部分鲜重明显低于野生型。

11、(4)本发明证明ossapk5通过影响渗透调节物质如脯氨酸的积累参与水稻盐胁迫响应，对175mm nacl处理前后植物体内游离脯氨酸含量进行测量，结果显示，175mm nacl处理后s5-1和s5-2突变体株系游离脯氨酸含量显著低于野生型植株，脯氨酸的生物合成是依赖于osp5cs表达产物的催化，qrt-pcr数据显示，osp5cs的表达水平在s5-1和s5-2突变体株系中远低于野生型。

12、(5)本发明证明ossapk5通过影响抗氧物质的含量提高水稻盐胁迫能力，比较175mm nacl处理前后野生型和突变体株系叶片中超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod)、过氧化物酶(peroxidase，pod)和过氧化氢酶(catalase，cat)活性以及抗坏血酸(ascorbate oxidase，asa)含量；在正常条件下，野生型和突变体株系叶片中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，sod)、过氧化物酶(peroxidase，pod)和过氧化氢酶(catalase，cat)活性以及抗坏血酸(ascorbate oxidase，asa)含量没有显着差异，175mmnacl处理后，s5-1和s5-2突变体株系中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)、过氧化物酶(peroxidase，pod)和过氧化氢酶(catalase，cat)活性以及抗坏血酸(ascorbateoxidase，asa)含量均明显低于野生型。

技术特征：

1.水稻蛋白激酶基因ossapk5在提高水稻抗盐能力中的应用，所述基因ossapk5的dna序列如seq no：1所示。

技术总结
本发明公开了水稻蛋白激酶基因OsSAPK5在提高水稻抗盐能力中的应用，通过从水稻叶片中克隆到OsSAPK5基因，构建亚细胞定位表达载体进行基因亚细胞定位，利用CRISPR/Cas9技术构建了sapk5突变体S5‑1和S5‑2，进一步探究了OsSAPK5基因的功能，发现盐胁迫下sapk5突变体植株种子萌发的耐性明显低于对照植株，幼苗的盐胁迫耐受性明显低于对照植株；进一步研究发现，OsSAPK5可以通过增加渗透调节物质如脯氨酸和可溶性糖等的积累，并提高水稻盐胁迫下的抗氧化酶的活性或者含量，提高水稻抗盐胁迫能力；本发明为培育耐盐性作物研究提供了潜在候选基因。

技术研发人员：娄灯吉,杨晓艳,陈祯,林怡,邓宇琦,林榕彬
受保护的技术使用者：玉溪师范学院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/21