一种从人源性血浆中纯化富含IgM的免疫球蛋白的方法及富含IgM的免疫球蛋白制剂与流程

本发明涉及生物工程，尤其涉及一种从人源性血浆中纯化富含igm的免疫球蛋白的方法及富含igm的免疫球蛋白制剂。

背景技术：

1、免疫球蛋白m(igm)是分子量最大的免疫球蛋白，主要由脾脏和淋巴结中浆细胞分泌合成。igm主要分布在血清中，以五聚体的形式存在，占血清总免疫蛋白的5％～10％。

2、igm可制成制剂，用于抗细菌感染和自身免疫疾病的治疗。其中，“从人体血浆中分离和纯化igm”是常用的igm制剂制备方法，但目前仅有biotest的产品上市，igm含量仅为12％，且当时纯化工艺和病毒灭活工艺有限，纯度较低，治疗效果和安全性有限。

3、目前已有一些专利公开了一些制备富含igm的方法。如，中国发明专利“cn201510612033-一种富含igm的人免疫球蛋白制剂及其制备方法”，所述富含igm的人免疫球蛋白制剂，其免疫球蛋白含量比例为：igm：13.8％、iga：0.7％、igg：85.5％，其igm含量与含量相当，无明显治疗优势；中国发明专利“cn116217708a-一种纯化人血浆igm的方法”，该专利中制备的igm含量过高(大于90％)，igg，iga，igm比例不合适，用药安全性很难保证，难以应用到产品上市；中国发明专利“cn115768789a-用于获得包含人血浆来源的免疫球蛋白m的组合物的方法”公开了一种igm的纯化方法，该方法介绍了igm的五聚体、双五聚体和多五聚体的性质，但是其制备的是含量大于90％的igm制剂，用药安全性难以保证；中国发明专利“cn115768789a-用于获得包含人血浆来源的免疫球蛋白m的组合物的方法”公开了一种igm的纯化方法，该方法有效去除大部分iga，igm含量可达30％，但其使用麦芽糖作为保护剂，对糖尿病患者有潜在风险。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于提供一种从人源性血浆中纯化富含igm的免疫球蛋白的新方法及基于上述方法得到的富含igm的免疫球蛋白制剂，采用该方法得到的免疫球蛋白中igm比例合理，且纯度较高，不仅能发挥有效治疗优势，还能保证用药安全性，同时不会对糖尿病患者带来风险。

2、本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

3、一种从人源性血浆中纯化富含igm的免疫球蛋白的方法，包括如下步骤：

4、s1、血浆融化：将血浆输送到融浆罐，用水温≤35℃的循环水进行夹层循环融浆；血浆融化后，停止水循环，血浆温度控制在0～4℃；

5、s2、冷沉淀离心：将融化后血浆离心分离冷沉淀，出液温度控制在0～4℃；

6、s3、凝胶吸附：将冷沉淀离心后血浆升温至10～20℃进行凝胶吸附；

7、s4、组分i分离：血浆温度控制在1～3℃，用醋酸-醋酸钠缓冲液调节血浆ph值至6.80～7.00，添加温度≤-15℃的乙醇，最终温度控制在-3～-1℃，加完乙醇后，ph值为6～8；接着，搅拌、离心，出液温度控制在-3～-1℃，得“组分i沉淀”和“组分i上清液”；

8、s5、组分ii+iii分离：将“组分i上清液”用醋酸-醋酸钠缓冲液调节ph值至6.80～6.85，加温度≤-15℃的乙醇，最终温度控制在-6～-4℃，加完乙醇后ph值为6.80～7.00；经搅拌、静置后，再开启搅拌，加入硅藻土，进行压滤；压滤过程中，上清液温度控制在-6～-4℃，得“组分ⅱ+ⅲ沉淀”和“组分ⅱ+ⅲ上清液”；

9、s6、组分iii分离：降温至0～3℃时，将“组分ⅱ+ⅲ沉淀”倒入反应罐中搅拌溶解；待沉淀完全溶解，用醋酸-醋酸钠缓冲液调整ph为5.10～5.30；降温至-1～0℃，继续搅拌，并加温度≤-15℃的乙醇，最终温度控制在-4～-6℃；接着，再分别进行搅拌、静置、压缩过滤处理；过滤过程中，保持出液温度为-6～-4℃，得“组分iii沉淀”和“组分iii上清液”；

10、s7、溶解：将“组分iii沉淀”溶于注射用水中；

11、s8、辛酸沉淀：用辛酸或辛酸盐处理上述溶解液以沉淀杂质，过滤，得滤液；

12、s9、层析：将上述步骤所得滤液调节ph至4.0～5.5，电导率调至1.0～4.0ms/cm，用阴离子交换层析纯化，收集流穿液；

13、s10、将上述步骤所得流穿液ph值调至4.0～4.5；超滤浓缩至蛋白浓度5％以上，用注射用水透析，浓缩后得到一次超滤液；加入10±1％的甘氨酸进行稀配，得一次稀配液；

14、s11、将上述步骤所得一次稀配液用除菌滤芯进行除菌过滤；除菌过滤后制品放置在ph至4.0～4.5的孵放室孵放；

15、s12、浓缩、稀配：用透析液透析，使蛋白液浓缩，并加入甘氨酸至终浓度5％，调节ph至4.0～4.5；

16、s13、分装，冻干，干热病毒灭活。

17、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s1中，先领原料血浆袋，再用75％乙醇消毒血浆袋，随后用水温≤35℃注射用水冲洗尽乙醇后，进行破袋；破袋后，将袋内的血浆输送到融浆罐。

18、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s2中，离心速度不大于4kg/分钟/台。

19、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s4中，醋酸-醋酸钠缓冲液的ph值为4.0，添加速度≤1.0kg/分钟；乙醇为95％乙醇，添加终浓度为8％，添加速度≤1.5kg/分钟；搅拌30分钟以上，进行离心，离心过程出液流速不超过4kg/分钟/台。

20、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s5中，醋酸-醋酸钠缓冲液的ph值为4.0，添加速度≤1.0kg/分钟；乙醇为95％乙醇，添加终浓度为20％，添加速度≤1.5kg/分钟；搅拌120分钟以上后，静置60分钟以上，再开启搅拌，按每升反应液加入18g硅藻土，进行压滤；压滤过程中，进液压力不超过0.20mpa；压滤得“组分ⅱ+ⅲ沉淀”和“组分ⅱ+ⅲ上清液”，“组分ⅱ+ⅲ上清液”用于人血白蛋白生产，“组分ⅱ+ⅲ沉淀”用于免疫球蛋白产品生产或冻存。

21、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s6中，利用0.01mol/l氯化钠溶解“组分ⅱ+ⅲ沉淀”，待沉淀溶解，用ph4.0醋酸-醋酸钠缓冲液调整ph，且缓冲液添加速度≤0.5kg/分钟；继续搅拌至少10分钟，加95％乙醇，使反应液最终的乙醇浓度为17％，乙醇添加速度≤1.5kg/分钟；加完乙醇继续搅拌2小时，静置4小时以上，进行压缩过滤；启动反应罐搅拌器，使硅藻土与反应液混匀10分钟以上，边搅拌边过滤，在过滤过程中过滤压力不超过0.2mpa。

22、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s7中，取“组分iii沉淀”溶解于注射用水，使用0.5m醋酸调整ph至4.20，室温搅拌2小时，充分溶解。

23、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s8的具体步骤为：

24、(1)加入辛酸或辛酸盐至终浓度30mm，接着调ph至4.0～5.5，室温搅拌2小时；

25、(2)离心去除沉淀，上清液0.22um滤膜过滤；

26、(3)将浓缩液浓度浓缩至1.5％～3％。

27、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s9的具体步骤为：

28、(1)将滤液的ph调至4.0～5.5，电导率调1.0～4.0ms/cm；

29、(2)层析填料为capto q或fractogel emd tmae；

30、(3)采用ph 4.0～5.5，10～15mm的naac缓冲液平衡；

31、(4)样品上样后，用含120～180mm nacl缓冲液冲洗，丢弃上样流穿和洗脱组分；

32、(5)用含300～500mm nacl和0～10mm的naac的缓冲液洗脱，收集洗脱组分。

33、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s10中，将上述步骤所得流穿液加1.0mol/l盐酸溶液调整ph值至4.0。

34、作为本发明的优选方式之一，所述步骤s11中，除菌过滤后制品放置在低ph孵放室(ph4.0)，经24±1℃低ph孵放21天。

35、一种富含igm的免疫球蛋白制剂，包括上述从人源性血浆中纯化富含igm的免疫球蛋白的方法制得免疫球蛋白产物；所述免疫球蛋白产物中的ig纯度大于95％，且所述ig中包括如下重量百分比含量的活性成分：igm 20.3％～27％，igg 60.9％～64.9％，iga12.1％～14.8％。

36、作为本发明的优选方式之一，所述富含igm的免疫球蛋白制剂还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分，且具体由所述免疫球蛋白产物及药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。

37、本发明对分离条件进行优化，能够保证产品去除“除免疫球蛋白外绝大部分的杂蛋白”，即提高ig纯度的同时，合理提高igm含量，从而得到igm含量更高、纯度更好的免疫球蛋白制品，具有很好的成药前景。具体优势如下：

38、(1)通过调节参数，只使用辛酸沉淀和阴离子层析等纯化步骤，尽量在这些步骤中不使用低温乙醇沉淀，无需低温环境、能耗低、安全，且环境污染风险小，工艺连续性好，可较好地实现数字化、自动化控制，能够放大生产；

39、(2)最终免疫球蛋白ig中的组分比例为：igm 20.3％～27％，igg 60.9％～64.9％，iga 12.1％～14.8％，且ig整体纯度大于95％；相比上市产品本发明igm含量相对更高，可有效去除凝血酶等杂质，避免血栓风险，且ig纯度更高，可以有效提高疗效和安全性；相比其他现有专利方法，本发明igm比例合理，且ig纯度高，不仅能发挥有效治疗优势，还能保证用药安全性，同时不会对糖尿病患者带来风险；

40、(3)由于igm是五聚体，分子量大，很难使用目前“静注免疫球蛋白常用的纳米膜过滤”的方法，使用低ph孵放和干热等灭活病毒方法，可有效灭活多种病毒，降低病毒的生物负载。