一种微流控细菌真菌流式检测仪及其检测方法

本发明属于细菌真菌检测，具体涉及一种微流控细菌真菌流式检测仪及其检测方法。

背景技术：

1、由细菌及真菌引起的食源性疾病会严重危害人体健康，导致人体腹泻、呕吐、头痛或脱水，严重的会引发休克、肝功能损坏甚至危及生命。食品中常见的致病菌包括致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特氏菌等；常见的真菌污染通常由霉菌引起，主要为黄曲霉菌。国家对这一类的细菌真菌污染在食品中的限量做出了严格标准，在食品中不允许或至多允许100cfu/g的致病菌存在。

2、食品中的细菌真菌检测通常存在于食品生产、加工、储存及运输等过程中，可多方面实时检测并及时判断产品是否被污染，因此，检测需快速准确的进行；同时，基于严格的国家标准要求，在检测过程中也需要高精度的检测方式。细菌真菌的检测主要包括传统方法和现代方法；传统方法是基于培养和分离的方法，包括定性分析和定量分析，传统方法为分离培养出微生物进行鉴定，但鉴定时间长，人工投入多，不能满足快速检测的需求；现代方法主要包括生物化学技术、分子生物学技术及免疫学技术等，这些方法检测快速，但也存在操作复杂、仪器昂贵以及对样品处理要求高等缺点。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种微流控细菌真菌流式检测仪及其检测方法，操作简单，可有效提高抽样检测效率，减少人工投入。

2、为解决其技术问题所采取的技术方案是，提供一种微流控细菌真菌流式检测仪，包括液流模块、光学检测模块及电路模块；

3、液流模块包括微泵及微流控芯片；微流控芯片内含有被测菌液注入口、标记试剂注入口、混合通道和检测通道；

4、光学检测模块包括激光器、透镜、二向色镜、物镜、滤光片及光电探测器；激光器发射出激光束，激光束穿过透镜经二向色镜反射后形成第一光束，第一光束依次穿过物镜及微流控芯片后形成第二光束，第二光束依次穿过物镜、二向色镜及滤光片后被光电探测器接收；电路模块包括数模转换器及控制电路。

5、本发明采用上述技术方案的有益效果为：本发明的液流模块以无鞘流微流控芯片的形式实现，对流体的控制要求较低，可实现普及化检测；微流控芯片集成了预处理、流体控制与检测模块三大模块，将待测溶液样本预处理、染色与检测一体化集成，检测快速且方便；通过光学检测模块及电路模块判断聚集的细菌真菌数量，具有检测精度高和选择性好的特点，检测精度可达到单菌级别。

6、优选的，混合通道为蛇形、z字形或微柱镶嵌形；检测通道为直管道；混合通道与检测通道的高度均为5～50μm，宽度均为10～300μm；混合通道的长度为2～5cm；检测通道的长度为0.5～2cm。

7、本发明采用上述技术方案的有益效果为：在微流控芯片的小管道中流体的雷诺系数较低，形成的是层流现象，不利于混合，大部分只能通过扩散，本发明所涉及的混合通道能产生额外的流体扰动形成湍流，并且增大接触面积和延长接触时间，从而提高混合效果；检测通道为直管道避免了杂散光的干扰，保证测试的准确度；同时设置混合通道高度为5～50μm，宽度为10～300μm及长度为2～5cm，增大了标记试剂与被测菌液的接触面积，延长接触时间，检测通道长度为0.5～2cm时更利于激光的穿透和测定。

8、优选的，微流控芯片的材质为聚二甲基硅氧烷、玻璃和有机玻璃中的至少一种。

9、本发明采用上述技术方案的有益效果为：以聚二甲基硅氧烷、玻璃和有机玻璃中的至少一种作为微流控芯片的材质，生物兼容性好、机械强度高、易加工及透光性好，可减少激光照射时的误差干扰，提高测试准确度。

10、优选的，微泵为蠕动泵、注射泵或柱塞泵。

11、本发明采用上述技术方案的有益效果为：蠕动泵、注射泵或柱塞泵的泵体结构简单，体积小，输送液体的流量均匀，输入液体的速度可根据实际情况进行调整，可以实现液体流量的可控且精准输送。

12、优选的，激光器为波长为200～600nm的半导体激光器；光电探测器为ccd图像传感器、cmos图像传感器、雪崩光电二极管或光电倍增管pmt。

13、本发明采用上述技术方案的有益效果为：半导体激光器体积小、重量轻，输出的光速质量好且抗干扰能力强；ccd图像传感器、cmos图像传感器、雪崩光电二极管或光电倍增管pmt灵敏度高，可检测出较为微弱的光信号，抗干扰能力强且反应迅速，可实现高精度及快速检测。

14、优选的，电路模块基于现场可编程门阵列实现，fpga芯片包括ep4ce10f17c8n。

15、本发明还提供上述微流控细菌真菌流式检测仪用于检测细菌真菌的方法，包括以下步骤：

16、s1：将被测液体样本和标记试剂分别注入微流控芯片的被测菌液注入口及标记试剂注入口中；

17、s2：开启微泵将被测液体样本和标记试剂送入混合通道进行混合及荧光标记；

18、s3：再通过微泵作用将s2得到的混合溶液泵入检测通道；

19、s4：打开激光器，激光器产生的激光经透镜、二向色镜及物镜射入检测通道，荧光再透过物镜、二向色镜及滤光片被光电探测器收集；

20、s5：收集后的荧光转化为电信号，经电路模块处理，得细菌真菌的图像或荧光强度值；

21、s6：分析图像或荧光强度值，得样品中细菌真菌的数量，再根据泵入样本的体积计算样本中细菌真菌的浓度。

22、本发明采用上述技术方案的有益效果为：将被测液体样本和标记试剂分别注入微流控芯片的被测菌液注入口及标记试剂注入口中，以实现加样操作，通过微泵的动力将样本及试剂泵入混合通道，混合通道内产生额外的流体扰动形成湍流，并且增大接触面积和延长接触时间，从而提高混合效果；再通过微泵的作用将混合溶液泵入检测通道，开启激光后，激光顺利穿过为直管道的检测通道为直管道，输出的光信号被捕捉，经电流放大及转换后可得到准确的测试结果，可实现高精度及快速检测。

23、优选的，被测液体样本和标记试剂的体积比为1～2:1～2。

24、本发明采用上述技术方案的有益效果为：被测液体样本和标记试剂的体积比为1～2:1～2可使的标记试剂较为充分的标记被测液体样本中的菌体，保证测定结果的准确性。

25、优选的，标记试剂包括荧光试剂和细胞透化剂；荧光试剂为sybr greenⅰ、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、聚集诱导发光材料和修饰抗体和适配体的量子点中的至少一种；细胞透化剂为聚乙烯亚胺、曲拉通x-100、乙基苯基聚乙二醇、乙醇、十六烷基三甲基溴化铵和聚山梨酯-20中的至少一种。

26、本发明采用上述技术方案的有益效果为：利用sybr greenⅰ或4',6-二脒基-2-苯基吲哚作为荧光染料，具有高灵敏度、宽谱带激发及易与dna结合的优点，染色效率高；以洗涤剂聚乙烯亚胺、曲拉通x-100、聚山梨酯-20或有机试剂十六烷基三甲基溴化铵、乙醇等作为透化试剂，可加快菌体的染色过程，便于后续荧光观察；聚集诱导发光材料具有特殊的化学结构，具有较好的增强发光效果；修饰抗体或适配体的量子点可与不同菌体特异性结合并标记菌体，结合了量子点的菌体通过荧光检测可产生不同信号以实现菌体的区分，具有较高的灵敏度及特异性，可提高检测速度。

27、更优选的，聚集诱导发光材料为四苯基乙烯衍生物；修饰抗体或适配体的量子点为硒化镉、碲化镉和碳量子点中的至少一种。

28、本发明具有以下有益效果：

29、(1)本发明的微流控细菌真菌流式检测仪，用微流控芯片集成了预处理、流体控制与检测模块，具有体积小、重量轻的特点，可用于现场检测；

30、(2)本发明的微流控细菌真菌流式检测仪中液流模块以无鞘流微流控芯片的形式实现，对流体的控制要求低，具有高度集成化、结构简单且高效低耗的优点；

31、(3)本发明将待测溶液样本预处理、染色与检测一体化集成，具有检测快速和自动化运行的优点；

32、(4)本发明通过光电探测器荧光强度判断聚集的细菌真菌数量，通过特异性识别的量子点区分不同的菌体，具有检测精度高和选择性好的特点，检测精度可达到单菌级别；

33、(5)本发明中的细菌真菌的检测方法，操作简单，有效提高了抽样检测效率，减少了人工投入，适合于大规模自动化检测。