一种阴道壁组织类器官模型构建的方法与流程

本发明属于生物医药，具体涉及一种阴道壁组织类器官模型构建的方法。

背景技术：

1、依据目前已发表专利《一种高效的人阴道壁组织单细胞悬液制备方法》(cn112680404a)，公开了将阴道的组织块清洗、碎解、离心、加入胶原酶i型消化，时间为180min，消化过程中振荡，过滤、重悬等步骤获得活性较高杂质较少的阴道壁组织单细胞悬液。该方法消化酶单一，消化耗时长。

2、专利《一种阴道上皮细胞分离培养方法》(cn111088219a)公开了：剪碎组织，先用消化液a消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；剩余的组织继续加入混合消化液消化，然后过70微米细胞筛，收集细胞；把两次收集的细胞离心，用培养基清洗若干遍后，铺于matrigel预包被的细胞培养板中，得到阴道上皮细胞，在体外进行二维培养阴道上皮细胞扩增。二维培养只有与培养表面接触的一侧发生细胞吸附。许多细胞从组织中分离出来并置于平面细胞培养表面时，会逐步变得更加扁平，分裂异常，并丧失其分化表型。

3、专利《一种胃癌类器官的无血清专用培养基与类器官培养方法》(cn116536266)，公开了消化过程采用1)将剪碎的胃癌组织进行预处理后进行消化，收集细胞沉淀；2)将细胞与matrigel胶按一定比例混匀并接种在低吸附板上，待混合胶凝固后，加入配制的专用培养基，并于37℃、5％co2浓度下培养4-10天，即得，但是该文件中公开的方法使用的培养基不适合阴道壁组织类器官培养，且使得形成的类器官细胞的时间较长且其类器官细胞数量降低，活性低。

4、3d培养优势，整个细胞表面都可以发生细胞吸附，细胞吸附和伸展的程度影响其增殖、凋亡和分化功能。3d培养可以建立起生理上的细胞-细胞与细胞-细胞外基质相互作用，模拟天然组织的特异性。3d培养模型的另一个重要的生理特性是适宜的细胞极性。体内的极性取决于细胞类型和组织微环境。上皮细胞通常都是有极性的，有顶面和基底外侧表面，这对组织的结构和生物活性分子的定向分泌很重要。

5、因此如何缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，以及如何实现在体外进行3d培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建成为需要解决的问题。

技术实现思路

1、本发明的目的提供了一种用于培养阴道壁组织类器官的培养基，包括基础培养基s-reduce减血清dmen/f12(1:1)培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：b-27tmsupplement(50x),serum free，0.5-5×；n-2 supplement(100x)，1-5×；nicotinamide，1-10mm；n-acetylcysteine，0.2-5μm；n-acelyl-l-cysteine，0.5-5mm；egf，10-500ng/ml；noggin，20-500ng/ml；r-spondin 1，100-1000ng/ml；wnt3a，50-200ng/ml；chir99021，1-10μm；thiazovivin，0.5-5μm；vegfr，5-50ng/ml；pdgfr，5-50ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-5×；primocin，0.5-5mg/ml。

2、本发明的目的提供了一种阴道壁组织类器官模型构建的方法，为了解决如何缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，以及如何实现在体外进行3d培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建的问题，本发明提供的方法，通过改进酶解液配制，缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，本发明的用于培养阴道壁组织类器官的专用培养基，用于在体外进行3d培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建。

3、为了解决上述技术问题，本发明的阴道壁组织类器官模型构建的方法该方法包括：

4、(1)组织酶解：将清洗后剪碎至小块或糊状的人阴道壁手术组织经组织酶解液重悬剪碎组织，酶解40-80min；

5、(2)过滤收集细胞：将酶解后的细胞过滤，用含血清的dmem培养基清洗细胞、离心、弃上清，后用红细胞裂解液进行红细胞裂解、离心、弃上清后得到阴道壁组织细胞沉淀；

6、(3)细胞原代培养：将细胞沉淀用阴道壁组织类器官培养基重悬混合matrigel后加入24孔低吸附细胞培养板中，置于37℃、5％co2孵箱中孵育使其形成凝胶，加阴道壁组织类器官的培养基进行培养，后得到d1阴道壁组织类器官，阴道壁组织类器官的培养基如上所述的：包括基础培养基s-reduce减血清dmen/f12(1:1)培养基和特异性添加因子；所述特异性添加因子包括以下终浓度的组分：b-27tmsupplement(50x),serum free，0.5-5×；n-2supplement(100x)，1-5×；nicotinamide，1-10mm；n-acetylcysteine，0.2-5μm；n-acelyl-l-cysteine，0.5-5mm；egf，10-500ng/ml；noggin，20-500ng/ml；r-spondin 1，100-1000ng/ml；wnt3a，50-200ng/ml；chir99021，1-10μm；thiazovivin，0.5-5μm；vegfr，5-50ng/ml；pdgfr，5-50ng/ml；青霉素链霉素混合液，1-5×；primocin，0.5-5mg/ml。

7、(4)类器官传代培养：将d1阴道壁组织类器官经过清洗、离心、弃上清，加入消化液消化2-10min，加入含血清的dmem培养基终止消化、离心、弃上清后重复步骤(3)，待细胞生长为d2阴道壁组织类器官；

8、步骤(1)中，置于37℃，5％co2培养箱中的摇床上震荡，转速50-150rpm条件下进行酶解；

9、步骤(1)中，组织酶解液为高糖dmem培养基,dispaseii含量0.1-1mg/ml,胶原酶含量0.1-1mg/ml，青霉素链霉素混合液1-5×，fbs含量总体积1-10％，dna酶0.1-0.2mg/ml；

10、在步骤(2)中，细胞过滤使用70μm细胞筛网进行过滤；

11、在步骤(2)中，离心200-400g，时间为3-5min；

12、在步骤(2)中，含血清的dmem培养基为高糖dmem培养基，加入青霉素链霉素混合液，1-5×，fbs含量总体积1-10％；

13、在步骤(3)中，孵育时间20-30min，在培养过程中，每隔2-3天补加一次液体培养基，培养4-7天后得到d1阴道壁组织类器官；

14、在步骤(4)中，采用pbs清洗1-2次，200-400g,离心3-5min，加入0.5-3ml细胞消化液在37℃培养箱消化2-10min，加入2-8ml含血清的dmem培养基终止消化；

15、在步骤(4)中，细胞消化液为tryple express或trypsin-edta solution或acctuase，优选为tryple express。

16、相比于现有技术，本发明的有益效果在于：通过改进酶解液配制，缩短细胞消化时间，短时获得较高活性的细胞，本发明公开的阴道组织专用培养基，用于在体外进行3d培养阴道组织类器官，实现细胞扩增完成模型构建，本发明公开的培养基和培养方法用于三维阴道壁组织类器官培养可有效促进细胞生长，最终形成类器官数量多，成活率高。