本发明属于分子医学，具体是涉及一种同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂。
背景技术：
：：1、梅毒(syphilis)是一种由梅毒螺旋体(treponema pallidum，tp)引起的性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性的，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。2011年以来，我国梅毒的发病数逐年增长，但显性梅毒的发生率却逐年下降，显性梅毒得到较好控制。然而，隐性梅毒大幅上升，占比高达80％以上。隐性梅毒患者无自觉症状，处于临床静止期(也称之为潜伏梅毒)，但仍具有传染性，可传染给胎儿或他人，是重要的传染源。一旦机体抵抗力下降，隐性梅毒将重新发作，进展为显性梅毒。研究表明约20％隐性梅毒可进展为神经梅毒。此外，抗生素尽管已经应用于各类梅毒的治疗，并有效控制患者继发的各种并发症，但不论使用哪种规范的治疗方案，都有治疗失败的可能，其中梅毒血清固定现象高达30％。鉴于梅毒螺旋体尚难于体外常规培养，至今没有直接有效的方法可以评价治疗效果。2、已有的文献和国内外指南曾认为，梅毒螺旋体非特异性抗体检测可用于评估梅毒疾病活动度或传染性，即随访滴度降低4倍以上或血清转阴表明治疗有效或治愈(satyaputra f.,hendry s.,braddick m.,et al.the laboratory diagnosis ofsyphilis[j].journal of clinical microbiology,2021,59(10):e0010021.10.1128/jcm.00100-21)，但其敏感性和特异性受到感染的分期和免疫抑制的严重程度的影响。此外，最近的动物试验研究显示，宿主梅毒螺旋体非特异性抗体的滴度变化与抗生素治疗无关，其滴度降低4倍以上或血清转阴均可能是一种自然过程(lin li rong,zhu xiao zhen,liu dan,et al.are nontreponemal tests suitable for monitoring syphilistreatment efficacy？evidence from rabbit infection models[j].clinicalmicrobiology and infection,2020,26(2):240-6.10.1016/j.cmi.2019.06.004)。如何梅毒的活动性和传染性，如何判断是否治愈，仍然是当前梅毒防控的难点，需要找到存在活的梅毒螺旋体的直接证据。3、梅毒螺旋体dna的载量可以反映梅毒螺旋体的存在以及数量，但不能区分活的或死的梅毒螺旋体。病原体mrna很容易降解，半衰期短，其存在表明存在活的病原体，提示具有传染性或尚未治愈。虽然有研究在梅毒患者的精液标本中检出梅毒螺旋体rna(godornes,charmie,ciccarese,et al.treponema pallidum subsp.pallidum dna andrna in semen ofa syphilis patient without genital oranallesions[j])，但目前被广泛研究并快速发展的pcr体系通常以梅毒螺旋体dna片段为靶标，尚未有成熟的pcr体系被建立并用于评估检测梅毒感染者体内的梅毒螺旋体基因组dna转录产生的mrna。4、梅毒螺旋体基因tp47(47kda脂蛋白)为特异性47-kda脂蛋白基因，是梅毒螺旋体最常见的表达基因，具有高度的特异性，该47-kda蛋白为青霉素结合蛋白，与青霉素类的治疗密切相关。5、梅毒螺旋体pola基因(dnapolymeraseⅰgene oft.pallidum)，是梅毒螺旋体的管家基因，序列具有高度的保守性，其特别功能区，有丰富的半胱氨酸和四个独一无二的插入区，在dna复制与修复中起重要的作用，应用pola基因检测梅毒螺旋体，有较高的敏感性和特异性。6、同时检测以上二个靶基因，可以最大限度提升灵敏度，减少由于突变或表达水平等因素造成的漏检。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna引物探针组合物。2、本发明的第二目的在于提供一种同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂盒。3、本发明的第三目的在于提供所述同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂盒制备方法。4、本发明的第四目的在于提供所述所述同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂盒的应用。5、一种用于同时检测梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna引物探针组合物，其特征在于所述引物探针组合物包括用于检测tp47基因的引物探针组合，用于检测pola基因的引物探针组合，以及用于检测rnasep基因的引物探针组合；具体序列如下：6、7、其中，fam、hex、cy5为荧光报告基团，bhq1和bhq2为荧光淬灭基因。8、一种梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒上述引物探针组合物。9、本发明所述梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂盒，包括pcr反应液、酶反应液、标准品、阴性对照品和阳性对照品。10、其中pcr反应液的成份含有dntp/dutpmix、mg2+、4对引物探针混合物和ddh2o。11、其中酶反应液的成份含有hiscript ii reverse transcriptase、rnaseinhibitor、heat-labile udg和takarataq hsdnapolymerase。12、标准品(含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液)包括1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml和1.0×107copies/ml共6个浓度。13、阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因和pola基因，只含人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。14、阳性对照品为含有梅毒螺旋体tp47基因和pola基因的目标片段的装甲rna溶液。15、所述梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr试剂的制备方法，包括以下步骤：16、1)靶基因筛选与制备17、从ncbi上下载梅毒螺旋体的tp47基因、pola基因和人类的rnasep基因核酸序列，根据引物设计原则，借助ncbi-primer blast、dnaman、primerpremier 5和tm utility等软件进行辅助设计，同时对这3个靶点分别设计一条带有不同荧光基团的taqman探针，tp47基因的探针为fam荧光基团、pola基因的探针为hex荧光基团、rnasep基因的探针为cy5荧光基团，由于这3条探针上的荧光基团具有不同的发射波长，因此可以根据不同波长的通道对这3个基因的扩增情况进行区别判断。接着，对设计好的引物用ncbi的primer blast工具进行在线的基因组和转录组同源比对，以确保设计的引物特异性良好，无潜在的非特异性扩增靶标。最后合成验证后的引物和探针，将合成验证后的引物和探针进行4000rpm，30s离心，用tris-edta缓冲液按照说明书进行溶解和稀释，之后用nanodrop 2000对引物和探针进行定量，稀释至100μm放置于-20℃作为储存溶液，稀释至10μm放置于4℃作为工作溶液。18、2)靶基因装甲rna的构建19、制备含靶基因装甲rna溶液：我们采用基于单质粒双表达系统对梅毒螺旋体进行装甲rna构建。以pet-24a(+)质粒作为载体，插入的外源基因包括梅毒螺旋体tp47基因片段、pola基因片段和人类rnasep基因片段，并在该外源基因的前面插入了t7终止子、启动子以及pac site共计约2700nt，使该外源基因能够独立于外壳蛋白基因而作为独立表达的序列。我们以bamhⅰ和hindⅲ为酶切位点，对外源片段进行基因合成后插入到pet-24a(+)表达载体，获得重组质粒petms2-tp，并用重组质粒petms2-tp对大肠杆菌bl21(de3)进行转化。再通过对大肠杆菌进行细胞破碎，获得含靶基因的装甲rna，然后进行双酶切实验并通过琼脂糖凝胶电泳观察产物条带，酶切后的装甲rna溶液置于75℃干浴5min，破坏其外壳蛋白，用rt-qpcr进行扩增验证两个外源目的片段是否存在。对rt-qpcr的扩增产物进行回收，对产物进行sanger测序验证，然后利用dnaman软件将测序结果与靶片段序列进行比对，判断扩增产物是否正确。sds-聚丙酰胺凝胶电泳验证用于初步判断其外壳是否有表达。最后采用peg沉淀法浓缩纯化含靶基因的装甲rna，将已知浓度的质粒倍比稀释后与纯化后的含靶基因的装甲rna同时进行rt-qpcr扩增，计算含靶基因装甲rna的浓度，获得已知浓度的含靶基因装甲rna溶液，用于标准品的制备。20、3)pcr反应液制备21、dntp/dutp mix、mg2+、3对引物探针混合物和无菌无酶的ddh2o共同组成pcr反应液。22、4)酶反应液制备23、vazymehiscript ii reverse transcriptase、vazymernase inhibitor、vazymeheat-labile udg、takara taq hsdnapolymerase共同组成酶反应液。24、5)对照品制备25、阴性对照品制备：制备不含梅毒螺旋体tp47基因和pola基因，只含人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。26、阳性对照品制备：制备含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。27、6)标准品制备和标准曲线的建立28、用tris-edta缓冲液稀释含tp47基因、pola基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液，选择1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×107copies/ml 6个浓度作标准品，分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围。所述的标准品浓度不限于1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×107copies/ml 6个浓度。29、7)样品处理方法的建立30、使用梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr检测试剂的标本主要包括人体的组织、血液、生殖道分泌物和脑脊液等临床标本，或者环境标本。采用总rna提取试剂提取样本中的rna核酸片段。样本核酸提取后得到的rna溶液选用thermo fisher scientific的dna-freetmdna去除试剂依照说明书去除样本中残留的dna。31、8)梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr检测试剂的制备32、pcr反应液、酶反应液、标准品和对照品共同组成梅毒螺旋体tp47和pola双基因mrna一步法pcr检测试剂。33、在步骤3)中，所述引物探针混合物的引物的浓度为0.2μmol/l，荧光探针的浓度为0.2μmol/l。34、本发明在同一反应管中同时实现了对梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和人类rnasep基因的检测，同时采用一步法rt-qpcr，将逆转录和核酸扩增步骤相结合，在减少污染发生的同时节省时间，且pcr反应液内含的dutp和酶反应液内含的udg酶共同构成防污染体系，进一步降低环境中气溶胶污染对实验结果可能带来的不利影响，双基因实时荧光定量pcr可以同时并定量检测样本中的tp47和pola两个靶基因，大大提高了检测的灵敏度，同时避免单基因突变造成的漏检，很大程度上提高了梅毒检测的准确性和灵敏度。当前第1页12当前第1页12