用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针及其应用

本发明涉及有机合成、荧光探针检测，尤其涉及一类用于检测生物样品中一氧化氮的小分子荧光探针和应用。

背景技术：

1、一氧化氮(no)是一种无色透明的有害气体，常被列为环境污染物，但却在人体中起着不可或缺的作用。在机体内，no是一种多功能信号分子，除了具备众所周知的血管舒张作用外，还与血小板粘性、细胞增殖、免疫反应、细胞凋亡、血管生成、神经传递等密切相关。正常生理状态下，人体内的no维持着相对稳定的浓度，但在炎症、肿瘤坏死因子、白细胞介素等刺激下，人体内会产生过量的no，从而危害人体健康。具体地，在神经元损伤的情况下，大脑中一氧化氮的浓度会激增几个数量级；过量的no本身会通过与线粒体发生相互作用来削弱细胞能量的产生；其次，no还可以产生活性氮和活性氧，进一步影响细胞功能。

2、尽管no对人体健康具有重要意义，但其在细胞信号通路和各种疾病中发挥的复杂生物学作用却尚未完全阐明。其中一个主要原因是缺乏有效的工具和方法对生物样品中的no进行无损地实时检测。因此，开发高效的no检测方法，在生物样品中实现对no浓度的实时快速监测，有助于探索no在相关疾病发生和发展过程中发挥的作用，以及理解no的各种病理生理学功能和角色。

3、目前已发展出来的no检测方法包括：电化学法、化学发光法、分光光度法、电子顺磁共振波谱法、光纤传感技术方法和荧光探针法等。其中，荧光探针法不仅能够实现对no的特异性检测，还具有成本低、灵敏度高、选择性好、操作简单、无侵入性和时空成像能力等优点，现已被广泛应用于no的检测。

4、基于此，我们发明了一类基于邻苯二胺结构优化的有机小分子荧光探针，用于生物样品中一氧化氮的特异性检测和成像。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供检测生物样品中一氧化氮的小分子荧光探针和应用，以解决现有的邻苯二胺类no荧光探针选择性不够好，设计策略不能满足高度模块化和普遍性的需求等问题。

2、为了解决这些问题，本发明将核心荧光团通过其酚羟基或芳香胺基以不同连接子(linker)连接于邻苯二胺类结构，发展了一个通用的探针模板。no与邻苯二胺类结构上的胺基发生亚硝基化反应，随后通过分子内环化并脱去一分子水形成苯并三氮唑结构，然后水解脱去苯并三氮唑并生成游离的荧光团，伴随着显著的荧光增强从而实现no的检测，可以将其用于生物样品中一氧化氮的特异性检测和成像。

3、下述反应流程为本申请的no荧光探针设计策略

4、

5、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

6、用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针，其特征在于：其结构通式i为：

7、

8、通式i中：

9、r1选自o、nh、nch3，r2选自h、ch3，r3选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh，r4选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh、n(ch2ch3)2、n(ch2ch2)2ch、nch3ch2ph、n(ch2)2ch2、n(ch2ch2)2、n(ch2ch2)2o、nch3ph、nhcho、nch3cho；

10、fl选自荧光团，取代荧光团；荧光团是指在特定波长下被激发，并发射出特定波长荧光的分子；

11、优选地，所述r1为nh、r2为h时，r3选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh，r4选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh、n(ch2ch3)2、n(ch2ch2)2ch、nch3ch2ph、n(ch2)2ch2、n(ch2ch2)2、n(ch2ch2)2o、nch3ph、nhcho、nch3cho；

12、优选地，所述荧光团的母体结构选自香豆素、萘酰亚胺、部花菁和半花菁染料荧光团。

13、优选地，包含以下其中之一的结构：

14、

15、

16、本发明还提供用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在检测一氧化氮中的应用。

17、本发明还提供用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在溶液、活细胞以及活体动物中一氧化氮检测中的应用。

18、本发明还提供用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在制备一氧化氮检测试剂盒或试纸中的应用。

19、本申请设计策略的最大优势在于其高度模块化和普遍性，由于探针对no的检测性能决定于邻苯二胺反应基团的结构，理论上可将核心荧光团替换为任何荧光团即得到一系列no荧光探针，从而大大简化探针的开发。邻苯二胺反应基团与核心荧光团的连接方式固定可以方便探针的合成。此外，该模块化设计策略极大地加速了对最佳邻苯二胺反应基团结构的筛选和优化。最后，在该设计策略中，邻苯二胺的其中一个胺基与荧光团通过羰基连接将有助于降低探针对潜在干扰物(如mgo、dha和aa等)的反应性，从而提高探针对no的选择性。

20、进一步，本发明提供的小分子光探针在与no反应之前仅发出微弱的荧光；在no存在的条件下，探针结构中的邻苯二胺单元能有效地与no反应，通过亚硝基化反应、分子内环化以及水解等过程生成荧光团母体，伴随着强烈的荧光增强，从而实现no的荧光检测，利于研究生物系统中no的稳态、信号传导和功能；

21、进一步，荧光探针在检测一氧化氮中的应用，得到波长从可见光到近红外区域的各种颜色no荧光探针，探针的no选择性好，灵敏度佳，no检测限能够低至0.16μm左右；

22、进一步，荧光探针在检测一氧化氮中的应用，所述的绿光区域和近红外区域探针均可应用于活细胞中no的检测。

23、进一步，荧光探针在检测一氧化氮中的应用，所述的近红外荧光探针还可用于活体成像。

24、本发明的有益效果在下述实施例中体现，不再重复描述。

技术特征：

1.用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针，其特征在于：其结构通式i为：

2.根据权利要求1所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针,其特征在于：所述r1为nh、r2为h时，r3选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh，r4选自h、ch3、och3、f、n(ch3)2、oh、n(ch2ch3)2、n(ch2ch2)2ch、nch3ch2ph、n(ch2)2ch2、n(ch2ch2)2、n(ch2ch2)2o、nch3ph、nhcho、nch3cho。

3.根据权利要求1所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针,其特征在于：所述荧光团的母体结构选自香豆素、萘酰亚胺、部花菁和半花菁染料荧光团。

4.根据权利要求1-3任一所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针，其特征在于：包含以下其中之一的结构：

5.根据权利要求1所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在检测一氧化氮中的应用。

6.根据权利要求5所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在溶液、活细胞以及活体动物中一氧化氮检测中的应用。

7.根据权利要求5所述的用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针在制备一氧化氮检测试剂盒或试纸中的应用。

技术总结
本发明公开了用于检测一氧化氮的一类小分子荧光探针及其应用。该探针是基于邻苯二胺结构优化的探针构建策略，改变邻苯二胺反应基团与荧光团的连接结构以及邻苯二胺的不同取代基，提高对一氧化氮的灵敏度和响应速率；改变荧光团的结构，得到绿色可见光和近红外光区域具有不同荧光颜色的一氧化氮荧光探针，用于缓冲液中一氧化氮检测和活细胞中一氧化氮荧光成像。本申请设计的一氧化氮荧光探针构建策略的模块化和普遍性得到了系统验证。未来还可将邻苯二胺反应基团通过碳酰胺结构连接到更多不同波长和光学性质的荧光团上，从而方便快捷地开发一系列一氧化氮荧光探针。

技术研发人员：彭涛,王墅塾,张雨晴
受保护的技术使用者：北京大学深圳研究生院
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24