一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用

本发明属于植物基因工程，公开了一种烟草抗青枯病基因ntwrky45及其在烟草抗青枯病中的应用。

背景技术：

1、烟草是重要的经济作物，在经济发展中发挥了重要作用，也是分子生物学研究的模式植物。由青枯雷尔氏菌(ralstonia solanacearum)引起的青枯病是重要土传性病害，目前仍无文献记载有效的防治手段。挖掘抗青枯病基因并阐明抗病机理，可为利用基因工程选育抗青枯病烟草品种奠定理论基础。

2、转录因子是一类显著调节植物生长和发育并在植物防御和胁迫应答中发挥重要作用的重要调节因子。wrky转录因子是植物中转录调控因子最大的家族之一。这些转录因子含有一个或两个wrky结构域，由60个氨基酸组成。它在n-末端具有保守的氨基酸序列wrkygqk，在c-末端具有c2h2型(cx4-5cx22-23hxh)或c2hc型(cx7cx23hxc)锌指基序，所有已知的wrky蛋白中至少存在一个wrky结构域。wrky转录因子可以调控应激反应中的植物激素信号转导途径，还能够通过结合w-box基序(ttgac/t)来激活或抑制下游基因的表达。wrky型转录因子参与植物生长，发育和胁迫反应的多个方面。近年来，越来越多的wrky tfs被发现涉及植物对非生物胁迫的反应。另外，wrky涉及植物防御反应的报道也很广泛。棉花中的ghwrky15基因参与了抗病反应。葡萄vvwrky1在烟草中过表达增强了烟草对各种真菌的抗性。随着生物技术的发展，运用转基因技术选育抗病虫等品种已成为农作物育种的热点。青枯病是一种毁灭性的细菌性病害，寄主范围很广，但除了拟南芥，尚未从正反向遗传学手段获得抗病基因，近年来，虽然在烟草抗青枯病研究方面己经开展了一些工作，但烟草抗青枯病分子机制及调控网络尚不清晰，烟草中wrky类抗青枯病基因报道更是甚少。

3、本研究基于实验室前期烟草基因芯片数据分析结果，获得了一个受青枯菌诱导表达的wrky类基因ntwrky45，构建过量表达载体经农杆菌介导转化烟草可显著增强对青枯菌的抗性，推测ntwrky45基因可能参与烟草对青枯菌的防御反应，可为植物抗青枯病遗传改良提供基因资源。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提出一种烟草抗青枯病基因ntwrky45及其在烟草抗青枯病中的应用，其将为植物抗青枯病基因工程的提供基因资源，具有重要的应用前景。

2、为了实现上述的技术目的，本发明所采用的技术方案为：

3、本发明申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导表达基因，blast分析表明该基因为烟草wrky转录因子中wrky45，命名为ntwrky45。根据其预测的cds序列设计引物，进行聚合酶联反应扩增该基因，结果表明，ntwrky45序列含有549个碱基对，编码182个氨基酸，其核苷酸序列如seq id no.1所示。ntwrky45编码的蛋白含两个wrky dna结合域，符合wrky类转录因子基因家族的特点，其编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

4、在上述基础上，本方案提供一种烟草wrky转录因子ntwrky45，其氨基酸序列如seqid no.2所示。

5、基于上述，本发明还提供编码权利要求1所述的烟草wrky转录因子ntwrky45的基因，其为ntwrky45基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

6、基于上述，本发明还提供一种超量表达载体，其包含上述所述的ntwrky45基因；本方案烟草ntwrky45基因的过量表达能够显著提高烟草对青枯菌的抗性，这为烟草抗青枯病的分子机理提供理论基础。

7、基于上述，本发明还提供一种烟草wrky转录因子ntwrky45基因的超量表达载体构建方法，其包括：基于gateway系统通过bp反应构建入门载体pdonr207-ntwrky45，再经过lr反应构建camv 35s启动子驱动的植物表达载体p35s::ntwrky45-tap。

8、本方案通过农杆菌介导的遗传转化，得到超量表达ntwrky45的转基因烟草植株，对其进行抗性鉴定，结果表明ntwrky45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。

9、基于上述，本发明还提供上述所述的烟草wrky转录因子ntwrky45在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

10、基于上述，本发明还提供上述所述的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

11、基于上述，本发明还提供上述所述的构建方法构建所得的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

12、采用上述的技术方案，本发明与现有技术相比，其具有的有益效果为：本方案申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导上调表达的wrky转录因子ntwrky45，经过pcr克隆获得编码该蛋白的cdna序列，通过基于gateway系统的bp和lr反应构建camv 35s启动子驱动ntwrky45基因植物表达载体p35s::ntwrky45-tap，将其转化gv3101农杆菌，通过叶盘法将其导入感病烟草品种红花大金元上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种抗性鉴定，结果证明ntwrky45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用价值。

技术特征：

1.一种烟草wrky转录因子ntwrky45，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述的烟草wrky转录因子ntwrky45的基因，其特征在于，其为ntwrky45基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.一种超量表达载体，其特征在于，其包含权利要求2所述的ntwrky45基因。

4.一种烟草wrky转录因子ntwrky45基因的超量表达载体构建方法，其特征在于，其包括：基于gateway系统通过bp反应构建入门载体pdonr207-ntwrky45，再经过lr反应构建camv 35s启动子驱动的植物表达载体p35s::ntwrky45-tap。

5.如权利要求1所述的烟草wrky转录因子ntwrky45或编码其的基因在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

6.如权利要求3所述的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

7.如权利要求4所述的构建方法构建所得的超量表达载体在烟草抗青枯病基因工程中的应用。

技术总结
本发明公开了一种烟草抗青枯病基因NtWRKY45及其在烟草抗青枯病中的应用，本方案申请基于前期烟草基因芯片数据筛选出的受青枯菌诱导上调表达的WRKY转录因子NtWRKY45，经过PCR克隆获得编码该蛋白的cDNA序列，通过基于Gateway系统的BP和LR反应构建CaMV 35S启动子驱动NtWRKY45基因植物表达载体p35S::NtWRKY45‑TAP，将其转化GV3101农杆菌，通过叶盘法将其导入感病烟草品种红花大金元上，对转基因烟草进行分子鉴定和青枯菌接种抗性鉴定，结果证明NtWRKY45可以正向调控烟草对青枯菌的抗性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用价值。

技术研发人员：陈华,庄伟建,王帅印,张冲,杨强,蔡铁城,巫升鑫,余文
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/27