一种猪病毒性腹泻的检测引物探针组合物、检测试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及分子生物，具体涉及一种猪病毒性腹泻的检测引物探针组合物、检测试剂盒及应用。

背景技术：

1、猪病毒性腹泻与仔猪死亡率极高有关，引起猪病毒性腹泻的主要临床病原体包括传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪德尔塔冠状病毒(pdcov)和猪轮状病毒a(porva)。

2、tgev和pedv属于α冠状病毒属，pdcov属于delta冠状病毒属，而porv属于呼肠孤病毒科轮状病毒属。pdcov可引起哺乳仔猪腹泻和呕吐，发病率和死亡率高达50-100％。猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科，根据vp6基因，porv被分为七个血清群(a-j)。目前，猪的a、b、c、e、h亚型轮状病毒已有报道，但a亚型轮状病毒是引起腹泻症状的主要血清型，世界各地的猪均证实有porva感染，患病率从3.3％到67.3％不等。各个年龄段的猪均可感染这四种病毒并出现临床症状，但新生仔猪感染后的急性腹泻尤为严重，死亡率很高，可达100％。

3、tgev、pedv、pdcov和porva感染仔猪可引起类似的临床症状，包括呕吐、腹泻和脱水。此外，tgev、pedv、pdcov和porva之间的混合感染和继发感染非常常见，它们之间的病理变化也非常相似，难以区分，这使得临床诊断相当困难。因此，临床上迫切需要建立快速、高效的分子方法来区分它们。因此，对猪病毒性腹泻的分子诊断方法需要不断更新，针对猪病毒性腹泻混合感染的情况，建立灵敏度高、特异性强、操作简单方便，并能鉴别诊断不同猪病毒性腹泻的检测方法十分必要，以确保更准确地进行流行病学监测，从而更好地制订预防和控制策略。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种使用方便、灵敏度高、可鉴别四种类型的猪腹泻病毒检测引物探针组合，具体提供一种猪病毒性腹泻的检测引物探针组合物、检测试剂盒及应用，本发明的检测试剂盒能够同时检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒a型，检测方法准确、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对病毒性腹泻进行快速检测和鉴别诊断。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种使用方便、灵敏度高、可鉴别四种类型的猪腹泻病毒检测引物探针组合物，所述组合物包括：

4、猪传染性胃肠炎病毒的引物序列为tgev-f、tgev-r，探针序列为tgev-p；其中引物的核苷酸序列如seq id no.1-2所示；探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；

5、猪流行性腹泻病毒的引物序列为pedv-f、pedv-r，探针序列为pedv-p；其中引物的核苷酸序列如seq id no.4-5所示；探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；

6、猪德尔塔冠状病毒的引物序列为pdcov-f、pdcov-r，探针序列为pdcov-p；其中引物的核苷酸序列如seq id no.7-8所示；探针的核苷酸序列如seq id no.9所示；

7、猪轮状病毒a型的引物序列为porva-f、porva-r，探针序列为porva-p；其中引物的核苷酸序列如seq id no.10-11所示；探针的核苷酸序列如seq id no.12所示。

8、在一些实施方案中本发明的组合物可以同时包括所述引物和探针中的一对或多对，在本发明中，“对”是指检测一个突变的互相匹配的上游、下游引物和探针。

9、在一个具体的实施例中，可以只包括猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物；可以只包括猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物；可以只包括猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物；可以只包括猪轮状病毒a型检测引物探针组合物。

10、在一个具体的实施例中，还可以只包括两对不同的检测引物探针组合物，例如猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物和猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物；例如猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物和猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物；例如猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物和猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物；例如猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物和猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物；例如猪流行性腹泻病毒检测引物组合和猪轮状病毒a型检测引物探针组合物；例如猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合和猪轮状病毒a型检测引物探针组合物。

11、在一个具体的实施例中，还可以只包括三对不同的检测引物探针组合物，例如猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物、猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物和猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物；例如猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物和猪轮状病毒a型检测引物探针组合物；例如猪流行性腹泻病毒检测引物探针组合物、猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物和猪轮状病毒a型检测引物探针组合物；例如猪传染性胃肠炎病毒检测引物探针组合物、猪德尔塔冠状病毒检测引物探针组合物和猪轮状病毒a型检测引物探针组合物。

12、进一步地，检测引物探针组合物内的探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。

13、进一步地，所述“互不相同且互不干扰”是指组合物中的每个探针所用的荧光基团是属于不同的检测通道的，例如可以使用fam、hex、rox和cy5，这些基团吸光值不相近，因而不会互相干扰。

14、在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光pcr。

15、在本发明中，荧光报告基团可以选择fam、vic、hex、rox、cy5、tamara、cy3和joe但不仅限于此。

16、进一步地，探针的3’端还具有淬灭基团，例如bhq1、bhq2或eclipse。

17、在一个具体的实施方案中，探针的3’端为bhq1。

18、在一个具体的实施方案中，探针的3’端为bhq2。

19、在一个具体的实施方案中，探针的3’端为eclipse。

20、进一步地，所述猪传染性胃肠炎病毒引物对、猪流行性腹泻病毒引物对、德尔塔冠状病毒引物对和猪轮状病毒a型引物对的引物终浓度全为：0.4μm、猪传染性胃肠炎病毒探针、猪流行性腹泻病毒探针、德尔塔冠状病毒探针和猪轮状病毒a型探针的终浓度全为：0.1μm。

21、在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各构成部分存在于同一个包装中。

22、进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

23、第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备一种同时检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒a型核酸的检测试剂盒中的用途。

24、第三方面，本发明提供了一种同时检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒a型核酸的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括如上所述本发明的组合物的任一种或两种以上的任意组合。

25、进一步地，所述检测试剂盒还包括rt-qpcr预混反应液、无rna酶水、阳性对照和阴性对照。

26、更进一步地，rt-qpcr预混反应液包括：荧光pcrbuffer、dntp、逆转录酶、taq酶和rna酶抑制剂；阳性对照包括：tgev、pedv、pdcov和porva的rna混合组合；阴性对照包括：无rna酶水。

27、在一个具体的实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒a型核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

28、1)提取或释放待测样本的核酸(rna)；

29、2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量pcr分析；

30、3)获得并分析结果。

31、进一步地，所述荧光定量pcr程序包括50℃，15min；95℃，120s；95℃，15s；60℃，30s；40个循环，每个循环的60℃时进行fam、hex、rox、cy5荧光信号的采集。

32、更进一步地，上述待检样本的结果判定包括：若阳性对照四个荧光通道ct值＜30并出现s型扩增曲线，且阴性对照无ct值，可判定实验结果成立。

33、待测样本fam通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸阳性；若无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸阴性；35＜ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为猪流行性腹泻病毒核酸可疑，需重新取样提取rna，进行复检，复检结果若ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；

34、待测样本hex通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪轮状病毒a型核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪轮状病毒a型核酸阴性；35＜ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为猪轮状病毒a型核酸可疑，需重新取样提取rna，进行复检，复检结果ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；

35、待测样本rox通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪传染性胃肠炎病毒核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪传染性胃肠炎病毒核酸阴性；35＜ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为猪传染性胃肠炎病毒核酸可疑，需重新取样提取rna，进行复检，复检结果ct值＜40判为阳性，否则判为阴性；

36、待测样本cy5通道ct值≤35并出现特异的s型扩增曲线，判为猪德尔塔冠状病毒核酸阳性；无ct值且无特异的扩增曲线，判为猪德尔塔冠状病毒核酸阴性；35＜ct值＜40并出现特异的扩增曲线，判为猪德尔塔冠状病毒核酸可疑，需重新取样提取rna，进行复检，复检结果ct值＜40判为阳性，否则判为阴性。

37、本发明的有益效果：

38、本发明的检测试剂盒能够同时检测猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪轮状病毒a型，也能够检测以上四种病毒的其中之一或任意组合，且检测方法准确、特异性和敏感性高，稳定性好，可对病毒性腹泻进行快速检测和鉴别诊断，以确保更准确地进行流行病学监测，从而更好地制订预防和控制策略。