一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法与流程

本发明属于微生物的，特别涉及一种将多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶avpal整合到ecn染色体的工程菌及其构建方法。

背景技术：

1、苯丙氨酸解氨酶(pal，ec4.3.1.5)广泛存在于高等植物及少数微生物中，可催化l-苯丙氨酸(l-phe)非氧化脱氨生成反式肉桂酸，pal在上个世纪六十年代被首次描述并引起了研究热潮。pal酶不仅可用于治疗苯丙酮尿症(pku)，还可用于抑制某些肿瘤细胞如白血病。

2、苯丙酮尿症是一种罕见的常染色体隐性遗传代谢疾病，其特征是无法代谢苯丙氨酸。健康机体中苯丙氨酸的代谢途径是由苯丙氨酸羟化酶(pah，ec 1.14.16.1)和辅酶四氢生物蝶呤(bh4)介导形成酪氨酸。而pku患者编码苯丙氨酸羟化酶的基因缺陷，使得苯丙氨酸不能转变成为酪氨酸，导致苯丙氨酸及其酮酸蓄积，高水平的苯丙氨酸具有神经毒性，还可导致严重的智力损伤、自闭症行为和癫痫发作等疾病。

3、近年来，随着医药科技的发展，苯丙氨酸解氨酶已成为苯丙酮尿症的一种治疗药物，通过皮下注射和口服的聚乙二醇化苯丙氨酸解氨酶，能够降低血液中苯丙氨酸的含量，从而减轻病情。如专利申请202011457369.7公开了一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌的构建方法，包括以下步骤：以具有l-苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌nissle1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。由此构建的工程益生菌能够用于治疗苯丙酮尿症。

4、专利申请202311217432.3公开了一种表达酪氨酸和苯丙氨酸解氨酶的重组菌株及其应用，通过基因查找手段，收集自然界中同时具有苯丙氨酸及酪氨酸降解活性的酶分子，并对其苯丙氨酸及酪氨酸降解活性进行体外活性检测，筛选得到具有优异活性的酶分子，将筛选出的酶分子转入肠杆菌中，进一步选出高表达酶分子且具有高效降解苯丙氨酸与酪氨酸能力的工程菌，然后为提高降解活性引入蛋白标签。最后通过肠胃液的耐受性实验筛选得到最优结构，得到了远高于现有降解活性的一株工程菌，耐受效果达到了该酶在益生菌中重组表达的最高水平，有望用于制备苯丙酮尿症与酪氨酸血症治疗药物。

5、同时，研究显示，口服表达pal的罗伊氏乳杆菌后，pku小鼠模型血液中phe水平降低，这表明基因工程益生菌有望成为治疗pku潜在疗法。到目前为止，有部分研究设计了工程菌株表达pal来实现降解苯丙氨酸，如synlogic公司研发的工程菌synb1618和synb1934能表达来源于发光杆菌photorhabdus luminescens的pal，已进展至人类临床研究。

6、2007年moffitt等在原核生物鱼腥藻中发现了pal，并解析了其晶体结构，对其酶学性质的研究表明其热稳定性优于酵母来源的pal，具有较好的工业应用前景。此外，由于具有优异的热稳定性，鱼腥藻pal用于治疗pku的研究越来越受到关注。

7、然而，目前对于多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶整合到工程菌的过程仍需探索。

技术实现思路

1、基于此，为解决抗生素耐药性肆虐问题，因此本发明的首要目地是提供一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法，该方法将多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶avpal整合到ecn染色体的工程菌，改造后的工程菌能有效表达重组苯丙氨酸解氨酶，具有优良的降解苯丙氨酸活性，同时不影响菌株的生长活性，为苯丙酮尿症治疗活菌药物的研发提供了一条新途径。

2、本发明的另一个目地在于提供一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法，该方法以escherichia coli nissle 1917(ecn)为底盘进行改造，利用crispr/cas9双质粒系统peccas/pecgrna，将组成型启动子p32、来源于多变鱼腥藻anabaena variabilis并进行了密码子优化的苯丙氨酸解氨酶基因avpal整合到ecn染色体，构建能表达苯丙氨酸解氨酶、降解苯丙氨酸、无抗性标记的遗传工程菌株ecn-avpal，并探究了敲除外膜脂蛋白pal对降解苯丙氨酸效果的影响。

3、为实现上述目的，本发明的技术方案为：

4、一种降解苯丙氨酸的工程菌构建方法，包括如下步骤：

5、步骤1，pecgrna-n20-avpal载体构建；

6、通过重叠pcr获得avpal表达框，重叠pcr获得avpal表达框及双酶切得到酶切载体pecgrna-n20。

7、进一步，苯丙氨酸解氨酶基因(avpal)进行密码子优化合成，avpal表达框的pcr扩增使用2×platinumtmsuperfitmiipcr master mix高保真酶，扩增引物为：pal-up-f、avpal-p32-r、p32-avpal-f、ins-r、t1-f、pal-down-r；

8、通过pcr扩增得到各片段，各片段为：上游同源片段up、启动子p32、苯丙氨酸解氨酶avpal、终止序列t1、下游同源片段down；再通过重叠pcr扩增得到avpal表达框up-p32-avpal-t1-down。

9、更进一步，上述扩增引物的序列为

10、pal-up-f的引物序列为：

11、tctctagagtcgacctgcagaagcttctgaccccggtagtacgtga；

12、avpal-p32-r的引物序列为：

13、cgcctggctcagggttttcatttcaaaattcctccgaatatt；

14、p32-avpal-f的引物序列为：

15、aatattcggaggaattttgaaatgaaaaccctgagccaggc；

16、ins-r的引物序列为：

17、actgagcctttcgttttatttgttaatgatgatgatgatggtg；

18、t1-f的引物序列为：

19、accatcatcatcatcat taa caaataaaacgaaaggctca；

20、pal-down-r的引物序列为：

21、cttatggagctgcacatgaactcgagcccaaatgtgttcgccagaag。

22、更进一步，pcr扩增得到各片段的基因序列为：

23、上游同源片段up：

24、ctgaccccggtagtacgtgaagtagatgaataactccgtcatcctgggcgaggaattcagcgtggcgaatcgctttgtcgctcaattccatttcgaaaacatccactggcatgatgattgttttgtacataagcattctctccttgtttttgcatgtatacataacagcacattattggttatgaatctataatttgcgaggctgatttgatctgaatttgctattgagctggaaaataaataaaaaccaggcgctaccagcgttgttcaaggtatagcactgcagcaacaataattgctgctatgaatatataaaatgcagtgataccgagagcttcgctca；

25、启动子p32：

26、tcgaattcggtcctcgggatatgataagattaatagttttagctattaatctttttttatttttatttaagaatggcttaataaagcggttactttggatttttgtgagcttggactagaaaaaaacttcacaaaatgctatactaggtaggtaaaaaaatattcggaggaattttgaa；

27、苯丙氨酸解氨酶avpal：

28、atgaaaaccctgagccaggcgcagtctaaaacctctagccagcagtttagcttcaccggtaactctagcgctaacgttatcatcggtaaccagaaactgaccatcaacgatgttgcacgtgttgcgcgtaatggcaccctggttagcctgaccaacaacaccgacatcctgcagggcatccaggcaagctgcgattacatcaacaacgcggttgaatccggtgaaccgatctacggcgttaccagcggcttcggtggcatggctaatgttgcaatctctcgtgaacaggcgagcgaactgcagaccaacctggtttggttcctgaaaaccggcgcgggtaacaaactgccgctggctgacgtacgtgcagcgatgctgctgcgtgcaaacagccacatgcgtggtgcatccggtatccgtctggaactgatcaaacgcatggaaatcttcctgaacgcgggcgttaccccgtacgtttacgaattcggcagcatcggcgcgtctggtgacctggttccgctcagctacattaccggtagcctgatcggtctggatccgagcttcaaagttgatttcaacggcaaagaaatggatgcaccgaccgctctgcgtcagctgaacctgtctccgctgaccctgctgccgaaagaaggtctggcgatgatgaacggtacctctgttatgaccggtatcgcggcgaactgtgtttacgatacccagatcctgaccgccatcgcgatgggcgtgcacgcgctggatatccaggccctgaacggcaccaaccagagcttccacccgttcatccacaacagcaaaccgcaccctggccagctgtgggctgcggatcagatgatcagcctgctggctaactcccagctggttcgtgacgaactggatggtaaacacgattaccgtgatcacgaactgatccaggaccgttacagcctgcgctgcctgccgcagtacctgggcccgatcgttgatggcatcagccagatcgctaaacagatcgaaatcgaaatcaacagcgttaccgacaacccgctgatcgatgttgacaaccaggcgagctaccacggcggtaacttcctggggcagtacgttggtatgggcatggaccacctgcgttactacatcggcctgctggcgaaacacctggatgttcagatcgctctgctggcaagcccggaattctctaacggtctgccgccgtccctgctgggcaaccgcgaacgtaaagtgaacatgggcctgaaaggtctgcagatctgcggcaacagcatcatgccgctgctgaccttctatggcaacagcattgcagatcgtttcccgacccacgctgaacagttcaaccagaacatcaactcccagggctacacctctgcgaccctggcgcgtcgttccgttgatatcttccagaactacgttgcgatcgcgctgatgttcggtgtgcaggctgttgatctgcgtacctacaagaaaaccggccactacgatgcgcgcgcgtgcctgagcccggcgactgaacgtctgtacagcgcggttcgccacgttgtgggccagaaaccgacctctgaccgcccgtacatctggaacgataatgagcagggtctggatgagcatatcgcgcgcatttcagcagacattgcagccggtggcgtgattgtgcaggcggttcaggacatcctgccgtgcctgcaccaccatcatcatcatcattaa；

29、终止序列t1：

30、caaataaaacgaaaggctcagtcgaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctctcctgagtaggacaaat；

31、下游同源片段down：

32、atcctctgggcaaagcgagttatcgcttgtgcagatgggattaaagcaggtaatcgccagcagcttctggctggtattcgagttccagcacttcaaggtgggttgcaacgccgcccggcagttcccagtgaatggaatcgccaacgcgcagccccagcagtgcggcacctaccggagccataacggaaagctgagtattgctgtcggtcatttttgccggatacaccagcgtgcgcacacgcacttcgccatcgctaagattgcggaatttaacccggctgttcattgtcaccacgtcgtgtggcatctcttctggcgaacacatttggg。

33、然后，进行pecgrna-n20-avpal载体构建；通过大肠杆菌crispr-cas9系统pecgrna/peccas(doi:10.1093/abbs/gmab036)将苯丙氨酸解氨酶基因表达盒avpal敲入ecn基因组中，通过t4连接构建pecgrna-n20载体。

34、进一步，avpal敲入ecn基因组时，插入基因组的位点为非编码区4168267-4169310(ncbi reference sequence:nz_cp022686.1)，设计n20靶点序列taagagcaaaatgataaatc。

35、再对pecgrna-n20载体进行酶切，连接pecgrna-n20酶切载体和avpal表达框up-p32-avpal-t1-down，转化dh5α感受态，构建pecgrna-n20-avpal载体；然后使用2x taq pcrmaster mix进行扩增，引物为fv和rv。

36、使用hindiii-hf和xhoi限制性内切酶对pecgrna-n20载体进行酶切，使用天根easygeno assembly cloning kit同源重组试剂盒连接pecgrna-n20酶切载体和avpal表达框up-p32-avpal-t1-down，转化dh5α感受态，构建pecgrna-n20-avpal载体；通过菌落pcr初步验证阳性克隆，使用2x taq pcr master mix进行扩增，引物为fv(ataccgagagcttcgctcatcgaattcggtcctcgggat)和rv(gacgctcagtggaacgaaaa)。

37、步骤2，ecn-avpal菌株构建；

38、pecgrna-n20-avpal质粒转化ecn(含peccas质粒)感受态细胞进行crispr基因插入，avpal表达框成功插入ecn基因组的阳性克隆ecn-avpal能扩增出大小约850bp的片段。

39、具体包括：

40、pecgrna-n20-avpal质粒转化ecn(含peccas质粒)感受态细胞，进行crispr基因插入。

41、菌落pcr验证苯丙氨酸解氨酶表达框avpal的插入：挑取在lb+kana+spec固体平板上的生长的单克隆菌落，以ecn基因组为模板pcr做阴性对照，菌落pcr扩增采用2x taq pcrmaster mix酶，验证引物为t1-f和ecn-r(ctgccaactcattcttgccac)。

42、质粒消除：将菌株ecn-avpal接入lb+kana+rhamnose液体培养基，进行培养；然后再将菌液稀释，涂布至lb+kana培养基，进行培养；消除pecgrna-n20-avpal质粒。

43、选取在lb+kana培养基上生长，在lb+kana+spec培养基不生长的ecn-avpal单菌落，接种于lb+glucose液体培养基进行培养；然后将菌液稀释，涂布至lb+glucose+sucrose培养基上进行培养，消除peccas质粒。

44、挑选在lb+kana、lb+spec固体平板上不生长，在lb固体平板上生长的单菌落分别接入lb、lb+kana、lb+spec液体培养基中培养，进一步验证质粒的消除情况。

45、基因组提取及pcr扩增：进行基因组提取及pcr扩增，基因组pcr扩增采用2×platinumtmsuperfitmiipcr master mix高保真酶，扩增引物为pal-up-f和pal-down-r。

46、步骤3，ecn-δpal-avpal菌株构建；

47、先进行ecn-δpal菌株构建，再进行ecn-δpal-avpal菌株构建。

48、进一步，进行ecn-δpal菌株构建，是通过pecgrna-n20(pal)载体构建实现的，具体为：对pal进行基因敲除，设计n20靶点序列agtcaccgtagaaggtcacg，通过t4连接构建pecgrna-n20(pal)载体；使用2×platinumtmsuperfitmiipcr master mix高保真酶扩增pal上下游片段，再通过重叠pcr连接pal上下游片段得到pal-up-down，pcr扩增引物为：pal-up-f、pal-up-r、pal-down-f、pal-down-r。

49、将pecgrna-n20(pal)载体和pal-up-down上下游片段共转化含ecn(含peccas质粒)的感受态，进行基因敲除。

50、更进一步，pal-up-f、pal-up-r、pal-down-f、pal-down-r的引物序列为：

51、pal-up-f：cggtcgtccgcaggtttat；

52、pal-up-r：taaaccagtaccgcacgacgcgaccaggcagggaatttga；

53、pal-down-f：tcaaattccctgcctggtcgcgtcgtgcggtactggttta；

54、pal-down-r：ctgaggctgtcgatctgcaa。

55、进一步，ecn-δpal-avpal菌株构建，是将pecgrna-n20-avpal质粒转化ecn-δpal(含peccas质粒)感受态细胞，进行crispr基因插入。

56、进一步包括有如下步骤：

57、步骤4，western-blot检测重组苯丙氨酸解氨酶的表达，具体包括如下步骤：

58、4.1菌体培养与破碎。

59、将ecn-wt、ecn-avpal和ecn-δpal-avpal菌株分别进行培养，然后从平板挑取单菌落分别接种于lb液体培养基，制备种子液；同时按照1％的接种比例，分别接种种子液至lb液体培养基进行培养约；培养结束调节至相同od600值，离心收集菌体，并对菌体进行洗涤，再加入pbs重悬进行菌体破碎，破碎完成后进行离心，分离得到裂解液和菌体沉淀。

60、4.2蛋白浓度测定。

61、对菌体进行蛋白浓度测定。

62、4.3sds-page凝胶电泳。

63、制备好的蛋白样品进行sds-page电泳。

64、4.4转膜。

65、取出sds-page凝胶，采用湿转法进行转膜。

66、4.5western blot。

67、转膜后pvdf膜置于tbst中清洗，再转入脱脂乳粉中封闭，添加一抗4℃冰箱过夜；然后进行tbst洗膜；更换新的脱脂乳粉，添加二抗室温慢摇2h；再经过5次tbst洗膜。

68、洗膜后进行显影，用成像仪拍照。

69、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

70、本发明以益生菌escherichia coli nissle 1917(ecn)为底盘进行改造，利用大肠杆菌crispr/cas9双质粒系统peccas/pecgrna，首先构建了pecgrna-n20-avpal载体，将启动子p32、密码子优化后的多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶基因avpal整合到ecn染色体，构建了ecn-avpal工程菌。又在此基础上，探究了敲除外膜脂蛋白pal对降解苯丙氨酸效果的影响。通过western-blot鉴定重组蛋白，证实了本发明构建的工程菌ecn-pal和ecn-δpal-avpal均能表达苯丙氨酸解氨酶。

71、本发明构建的表达苯丙氨酸解氨酶的工程菌ecn-avpal和ecn-δpal-avpal均能降解苯丙氨酸，具有优良的苯丙氨酸催化活性。

72、本发明通过基因工程技术，构建了能表达多变鱼腥藻苯丙氨酸解氨酶、催化苯丙氨酸且无抗性标记的遗传工程菌株ecn-pal和ecn-δpal-avpal，为苯丙酮尿症治疗活菌药物的研发提供了一条新途径。