抗CD70纳米抗体及其用途的制作方法

本发明涉及生物免疫治疗，具体涉及抗cd70纳米抗体及其用途。

背景技术：

1、cd70属于肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员，正常组织中cd70是一种ii型跨膜糖蛋白，仅仅短暂地表达在活化的t细胞、b细胞及成熟的树突状细胞中，cd27是其受体。在病理状态下，研究发现cd70高表达于多种肿瘤细胞中。目前以cd70为靶点的免疫治疗药物已经在临床前期研究中应用。

2、研究表明cd70在多种恶性肿瘤中表达均异常升高，包括肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤及其它肿瘤等，是一个有前景的肿瘤免疫治疗靶标。

3、嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptor-t cell，car-t)是一种针对肿瘤细胞表面特异性抗原的新型免疫治疗方法。现在，许多研究人员正在开发治疗实体瘤的car-t细胞。

4、抗体作为car中重要的组成部分，其对于car-t发挥特异性高效杀伤作用、降低毒性具有决定性影响。因此能够以高特异性结合目标抗原、同时具有低免疫原性的抗体是开发car-t产品的重点。羊驼体内能够产生特异性、亲和力高的vhh抗体，同时由于vhh抗体本身的特性使其能够识别传统scfv抗体不能识别的抗原表位，另外羊驼vhh基因与人vh基因具有较高的同源性，所以免疫原性比较低也利于人源化改造。本领域尚无含抗cd70纳米抗体的car-t细胞报道。

技术实现思路

1、本发明提供一种cd70结合分子，包含抗cd70纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗cd70纳米抗体的互补决定区cdr包含cdr1、cdr2和cdr3，其中cdr1包括seq id no:1-7中任一所示的序列、cdr2包括seq id no:8-13中任一所示的序列、和cdr3包括seq id no:14-20中任一所示的序列。

2、在一个或多个实施方案中，所述抗cd70纳米抗体的重链可变区序列如seq id no:21-28中任一所示。

3、在一个或多个实施方案中，所述抗cd70纳米抗体的fr1可选自seq id no:21-28中任一所示的vhh的fr1，fr2可选自seq id no:21-28中任一所示的vhh的fr2，fr3可选自seqid no:21-28中任一所示的vhh的fr3，fr4可选自seq id no:21-28中任一所示的vhh的fr4，

4、在一个或多个实施方案中，所述cd70结合分子是包含一条、两条或多条抗cd70纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体。

5、在一个或多个实施方案中，所述多价结合分子或多特异性结合分子通过连接子连接多个抗cd70纳米抗体或其抗原结合片段。所述连接子由选自g和s的1-15个氨基酸组成。

6、在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。

7、在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体还包含重链恒定区。

8、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含ch2和ch3。在一个或多个实施方案中，所述ch2和ch3是人igg fc的ch2和ch3，例如igg1的ch2和ch3。优选地，所述重链恒定区如seq id no:37所示。

9、在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含ch1、ch2、ch3、ch4和ch5。

10、在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的cd70结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。

11、本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体，包含任选的信号肽序列、本文任一实施方案所述的cd70结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。

12、在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。

13、在一个或多个实施方案中，从n端到c端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、本文任一实施方案所述的cd70结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。

14、本发明还提供核酸分子，其具有选自以下任一项的序列：

15、(1)本文任一实施方案所述cd70结合分子或嵌合抗原受体的编码序列；

16、(2)(1)的互补序列；

17、(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。

18、在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。

19、本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的核酸分子。

20、在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。

21、本发明还提供一种宿主细胞，选自：

22、(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述cd70结合分子或嵌合抗原受体；

23、(2)包含本文所述的核酸分子；和/或

24、(3)包含本文所述的核酸构建物。

25、在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞，优选t细胞。

26、本发明还提供一种产生本文任一实施方案cd70结合分子的方法，包括：在适合产生cd70结合分子(例如纳米抗体或其抗原结合片段，单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述cd70结合分子。

27、本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述cd70结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。

28、在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗cd70表达相关的疾病或病况。

29、本发明还提供本文任一实施方案所述cd70结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备活化的免疫细胞(例如t细胞)中的用途。

30、本发明还提供本文任一实施方案所述cd70结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗cd70表达相关的疾病或病况的药物中的用途。

31、在一个或多个实施方案中，所述疾病或病况选自以下的一种或多种：肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤。

32、本发明还提供一种治疗或预防cd70表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的cd70结合分子或宿主细胞，或本发明任一实施方案所述的药物组合物。

33、本发明还提供一种检测cd70的试剂盒，用于例如评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述cd70结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞。

34、在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测cd70与所述cd70结合分子的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。

35、在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与cd70结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述cd70结合分子或分离地存在于试剂盒中。

36、本发明还提供一种检测样品中cd70存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述cd70结合分子与样品孵育，和检测cd70与所述cd70结合分子的结合，从而确定样品中cd70存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。

37、本发明还提供本文任一实施方案所述cd70结合分子在制备用于检测样品中cd70、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。

38、本发明具有以下有益效果：

39、本发明提供了一种新的特异性识别cd70的迷你抗体以及含有该抗体的car修饰细胞，该抗体和细胞具有良好的安全性以及靶向cd70的治疗效果，为与cd70表达相关的疾病提供了新的治疗或改善途径。