一种同时生产D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法与流程

本发明属于生物，特别涉及一种同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法。

背景技术：

1、稀有糖d-阿洛酮糖和d-塔格糖是近两年备受瞩目的两种天然功能性低热量甜味剂，是良好的蔗糖替代品，它们生理功能丰富，兼具口感和安全性优势，在膳食、医药和保健等领域具有重要应用。研究稀有糖可以促进无糖食品的良好发展。相比天然原料提取法和化学合成法，生物转化法具有操作简单、成本低、环境友好等优点，是稀有糖大规模生产的首选方法，而全细胞生物转化法相较于酶生物转化法更加简单、高效且稳定。

2、d-塔格糖多由l-阿拉伯糖异构酶催化d-半乳糖得到，但是d-半乳糖价格高昂，作为底物生产d-塔格糖成本高、利润低。通过将水解乳糖为d-半乳糖和d-葡萄糖的β-半乳糖苷酶引入到d-塔格糖的生物转化过程中，为d-塔格糖的生物合成提供直接底物d-半乳糖，是解决底物成本高这一难题的有效方法。同理，葡萄糖异构酶和d-阿洛酮糖3-差向异构酶双酶级联可以催化乳糖水解产物之一的d-葡萄糖直接生产d-阿洛酮糖。另外，乳清粉是乳制品生产过程中的副产品，具有很高的生化需氧量，利用不当容易造成资源浪费和环境污染。乳清粉中乳糖含量一般为70%-80%，价格低廉，以其作为底物生产具有高附加值产品d-阿洛酮糖和d-塔格糖具有重要的环保经济价值。

3、因此，建立一种可操作性强、成本低且效率高的同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法具有重要现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法。

2、为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

3、本发明提供了一种同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法，包括以下步骤：

4、（1）将葡萄糖异构酶基因 gi连接到载体质粒pet28a的限制性酶切位点 nde ⅰ 和 bamhⅰ之间，构建得到重组质粒pet28a- gi；

5、（2）将d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因 dpe连接到所述步骤（1）的重组质粒pet28a- gi的限制性酶切位点 ecorⅰ和 xhoⅰ之间，构建得到重组质粒pet28a- gi-dpe；

6、（3）将l-阿拉伯糖异构酶基因 araa连接到载体质粒pht01的限制性酶切位点 bamhⅰ和 xbaⅰ之间，构建得到重组质粒pht01- araa；

7、（4）将β-半乳糖苷酶基因 lacz连接到所述步骤（3）的重组质粒pht01- araa的限制性酶切位点 xbaⅰ和 smaⅰ之间，构建得到重组质粒pht01- araa- lacz；

8、（5）将所述步骤（2）中的重组质粒pet28a- gi-dpe以1:10的体积比加入感受态细胞 e.colibl21 (de3)中，冰浴30 min，再在42 ℃水浴中热击45 s，立即冰浴2 min，而后加入lb液体培养基中37 ℃，200 rpm复苏1 h，再将菌液涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体平板上，37 ℃静置培养过夜；挑取单菌落转接至lb液体培养基中，并添加卡那霉素至浓度为100μg/ml，37 ℃、200 rpm培养12 h，得到双酶级联工程菌株 e.coli bl21 (de3)-pet28a- gi- dpe；

9、将所述步骤（4）中的重组质粒pht01- araa- lacz转化到 b. subtilis wb800n中至终浓度为10 µg/ml，充分混匀后放入37 ℃恒温水浴中静置45 min；然后放入37 ℃、200rpm的摇床中培养3 h；接下来，将菌液涂布于含有10 µg/ml氯霉素抗性的lb固体培养基平板上，37 ℃静置培养过夜；最后，挑取单菌落转接至lb液体培养基中，并添加氯霉素至终浓度为10 µg/ml，37 ℃、200 rpm培养12 h，筛选得到双酶级联工程菌株 b. subtilis wb800n-pht01- araa- lacz；

10、（6）将所述步骤（5）中的双酶级联工程菌株 e.coli bl21 (de3)-pet28a- gi-dpe接种于含有100 μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37 ℃、200 rpm培养至od600为0.6-0.8，然后加入诱导剂iptg至终浓度为0.025 mm，调整温度和转速为37 ℃和180 rpm继续诱导培养12 h；培养后的菌液14000 rpm离心5 min收集菌体。将收集的菌体用双蒸水洗涤菌体3±1次，离心收集菌体；

11、将所述步骤（5）的双酶级联工程菌株 b. subtilis wb800n-pht01- araa- lacz按照2%的接种量接种到含有10 µg/ml氯霉素的tb培养基中37 ℃、200 rpm培养至od600介于0.6至0.8，然后加入诱导剂iptg至终浓度为0.2 mm，继续诱导培养24 h；离心收集菌液，并用双蒸水洗涤2-3次，再次离心收集菌体；

12、用双蒸水分别调节双酶级联工程菌株 e.colibl21（de3）-pet28a- gi- dpe菌浓至od600=30， b. subtiliswb800n-pht01- araa- lacz菌浓至od600=50；分别取相同体积的两种工程菌株菌液，离心收集菌体，用含有乳糖的底物溶液依次混合重悬两种菌体定容至同一体积，以构建生物合成d-阿洛酮糖和d-塔格糖的反应体系，置于59-61 ℃恒温水浴锅中反应11-13 h；反应结束后，离心收集上清液，煮沸后再次离心，收集到的上清液经0.22 µm孔径的水系小滤器过滤，得到的滤液中含有d-阿洛酮糖和d-塔格糖。

13、进一步的，所述步骤（1）中的葡萄糖异构酶基因 gi具有下列核苷酸序列之一：

14、（1）如seq id no.1所示的核苷酸序列；

15、（2）与seq id no.1所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.2所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

16、进一步的，所述步骤（2）中的d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因 dpe具有下列核苷酸序列之一：

17、（1）如seq id no.3所示的核苷酸序列；

18、（2）与seq id no.3所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.4所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

19、进一步的，所述步骤（3）中的l-阿拉伯糖异构酶基因 araa具有下列核苷酸序列之一：

20、（1）如seq id no.5所示的核苷酸序列；

21、（2）与seq id no.5所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.6所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

22、进一步的，所述步骤（4）中的β-半乳糖苷酶基因 lacz具有下列核苷酸序列之一：

23、（1）如seq id no.7所示的核苷酸序列；

24、（2）与seq id no.7所示的核苷酸序列具有95%以上同源性且编码与seq id no.8所示的氨基酸序列具有相同功能氨基酸序列的核苷酸序列。

25、进一步的，所述步骤（6）的底物溶液中乳糖的浓度为140 g/l -200 g/l，其需要使用氢氧化钠调整ph至8.0。

26、进一步的，所述底物溶液还能够通过乳清粉或者其他含乳糖原料经过溶解制备得到。

27、进一步的，所述d-阿洛酮糖的转化率不低于8.0%，所述d-塔格糖的转化率不低于20%。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果和优点是：

29、1、本发明成功构建了一株能够催化d-葡萄糖为d-阿洛酮糖的双酶级联工程菌株 e.coli bl21 (de3)-pet28a- gi-dpe，还成功构建了一株能够催化乳清粉（乳糖）为d-塔格糖的双酶级联工程菌株 b. subtilis wb800n-pht01- araa- lacz。

30、2、本发明构建了一种同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法，利用该方法可以实现乳制品副产物乳清粉到两种高附加值稀有糖d-阿洛酮糖和d-塔格糖的生产，d-阿洛酮糖的转化率能够达到8.2%，d-塔格糖的转化率能够达到20.8%。

31、3、本发明提供的一种同时生产d-阿洛酮糖和d-塔格糖的方法具有高效、低成本的优点，且对于环境保护、经济发展和代糖生产具有重要意义。