牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法与流程

本发明涉及干细胞领域技术，尤其是指一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法。

背景技术：

1、牙髓间充质干细胞来源于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织细胞。近年来，通过各项研究表明，牙髓间充质干细胞与骨髓间充质干细胞的免疫表型及细胞形态等极其相似，牙髓间充质干细胞具有自我更新和多向分化的能力，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同因子的诱导，还能分化成为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。

2、目前，无血清牙髓间充质干细胞的大规模培养还存在着不少难题，牙髓间充质干细胞相比于脐带间充质干细胞等其它类型的干细胞更难扩增，目前的牙髓间充质干细胞的培养基通常是在脐带间充质干细胞培养基的基础上调节各营养物质而配成，不能针对性的提高牙髓间充质干细胞的扩增效果。在各类关于牙髓间充质干细胞的研究中表明，牙髓间充质干细胞培养离不开各类氨基酸及维生素，因此该发明选用了适合哺乳动物细胞生长的含丰富氨基酸成分的dmem/f12培养基。由于牙齿长期处于非无菌环境中，在获取牙髓组织时牙髓组织极易受到污染，为降低牙髓间充质干细胞的污染概率，该发明在培养基中添加了少量的抑菌物质——链-青霉素；在专利cn113481155a发明的骨髓间充质干细胞培养基中，研究表明地塞米松的加入可促进骨髓间充质干细胞的扩增，地塞米松也被称为泼尼松，是具有糖皮质激素作用的肾上腺皮质激素剂。在骨髓和牙髓间充质干细胞培养中，地塞米松是一种常用的添加剂，可以影响细胞的信号传递途径，从而提高干细胞的存活率和生长速度。地塞米松还可以抑制牙髓间充质干细胞成骨分化；在专利cn108795855a和专利cn114807028a及专利cn113481155a中，同时添加了碱性成纤维细胞生长因子、维生素溶液、表皮细胞生长因子、重组人胰岛素、重组人转铁蛋白、l-谷氨酰胺等物质给牙髓间充质干细胞提供营养，其中表皮生长因子（egf)、碱性成纤维细胞生长因子（bfgf)是维持细胞体外培养生存、增殖和分化所必需的补充因子。生长因子是有效的促有丝分裂原，能缩短细胞群体倍增时间；重组人胰岛素是一种多肽，它能与细胞上的胰岛素受体结合形成复合物，促进rna 、蛋白质和脂肪酸的合成，是重要的细胞存活因子；重组人转铁蛋白的作用在于受体与转铁蛋白与铁离子的复合物结合是细胞获取必需的微量元素铁的主要来源；l-谷氨酰胺作为能源及碳源物质能同时被细胞利用，是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡；维生素是维持细胞生长的一类生物活性物质，对细胞代谢有重大作用。牙髓间充质干细胞有了这些营养物质使细胞数量得到了有效的扩增。

3、目前常规的牙髓间充质干细胞培养基大多数以ɑ-men培养基、dmem培养基或dmem/f12培养基为基础培养基，另外添加fbs及其它生长因子来实现牙髓间充质干细胞的大规模培养，但fbs是属于动物源性物质，成分较为复杂，在临床应用上具有潜在的风险，也增加了细胞污染的概率，因此提供一种无动物源性、成分简单、组分确定、细胞增殖速率高的牙髓间充质干细胞无血清培养基以降低牙髓间充质干细胞的临床应用风险，并提高牙髓间充质干细胞的增殖效率显得尤为重要。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明针对现有技术存在之缺失，其主要目的是提供一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，其通过采用本技术提供的无血清培养基及其培养方法培养出的牙髓间充质干细胞的细胞质量稳定且得率高，利于牙髓间充质干细胞的培养应用。

2、为实现上述目的，本发明采用如下之技术方案：

3、一种牙髓间充质干细胞的无血清培养基，包括如下组分：体积浓度为90%-98%的dmem/f12无血清培养基、60-70ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子、40-60μg/ml的链霉素、40-60iu/ml的青霉素、0.5-1.5%v/v的维生素溶液、5-15nm的地塞米松、10-20ng/ml的表皮细胞生长因子、10-20μg/ml的重组人胰岛素、2-8μg/ml的重组人转铁蛋白、5-15ng/ml的血小板衍生因子pdgf、1-5mml-谷氨酰胺、15-30ng/ml的多聚赖氨酸、0.5-1.5%v/v的neaa、0.3-1ng/ml的亚硒酸钠和2-4%v/v水。

4、作为一种优选方案：所述无血清培养基包括95%dmem/f12无血清培养基、65ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、50μg/ml链霉素、50iu/ml青霉素、1%v/v维生素溶液、10nm地塞米松、15ng/ml表皮细胞生长因子、15μg/ml重组人胰岛素、5μg/ml重组人转铁蛋白、10ng/ml血小板衍生因子pdgf、3mml-谷氨酰胺、20ng/ml多聚赖氨酸、1%v/v neaa、0.5ng/ml亚硒酸钠和2.99%v/v水。

5、作为一种优选方案：所述dmem/f12无血清培养基由dmem培养基和f12培养基按照体积比为1:1混合而成。

6、作为一种优选方案：所述无血清培养基的制备方法包括如下步骤：

7、第一、将除dmem/f12无血清培养基以外的组分按比例混合，制得营养添加组剂；

8、第二、将混合均匀的营养添加组剂经滤膜进行过滤；

9、第三、将过滤后的营养添加组剂加入至dmem/f12无血清培养基中混合均匀得到无血清培养基。

10、一种牙髓间充质干细胞的培养方法，采用所述的牙髓间充质干细胞的无血清培养基；包括如下步骤：取新鲜或冻存复苏的p1代牙髓间充质干细胞制成细胞悬液进行计数，按计数结果根据所需种瓶密度计算出相应的细胞重悬体积，按重悬体积取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中，将接种好的细胞培养瓶置于37℃、5%co2的co2培养箱中培养；细胞融合度达到80-90%时进行细胞收获。

11、作为一种优选方案：所述牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞与含牙髓间充质干细胞无血清培养基的体积比为1:21。

12、作为一种优选方案：所述细胞收获的具体步骤为：将细胞培养瓶取出，用生理盐水清洗细胞表面，吸取掉生理盐水后加入6ml/t175瓶的胰酶消化液消化4min，后加入6ml/t175瓶培养上清终止消化；终止消化后细胞悬液用细胞滤网过滤，取过滤后的细胞悬液取样计数并检测细胞活率及细胞表型，剩余细胞离心后作冻存处理。

13、作为一种优选方案：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为5000-10000个/cm2。

14、作为一种优选方案：所述取牙髓间充质干细胞无血清培养基重悬细胞接种于含牙髓间充质干细胞无血清培养基的培养瓶中时的接种密度为9000个/cm2。

15、作为一种优选方案：所述p1代牙髓间充质干细胞的培养时间为72±24h，于72±24h中观察细胞融合度至80-90%时进行细胞收获；该胰酶消化液的浓度为0.125%。

16、本发明与现有技术相比具有明显的优点和有益效果，具体而言，由上述技术方案可知，通过采用本技术提供的牙髓间充质干细胞的无血清培养基及其培养方法，所培养的牙髓间充质干细胞的增殖能力较强；与常规的大规模牙髓间充质干细胞培养的方法相比，采用本技术培养方法培养出的细胞，细胞活率达90%以上，细胞表型（cd105、cd90、cd73、cd45、cd34）稳定且满足要求；本技术对于干细胞的规模化生产具有较高的价值，有利于推广应用；采用本技术提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞与含10%fbs培养基培养出的细胞每项检测结果均达到检测要求，其中牙髓间充质干细胞采用无血清培养基培养出的细胞内毒素检测结果略小于含10%fbs培养基培养出的细胞；本技术提供的牙髓间充质干细胞无血清培养基培养出的细胞安全性更高。

17、为更清楚地阐述本发明的结构特征和功效，下面结合附图与具体实施例来对其进行详细说明。