一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，尤其涉及一种稳定高效合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶基因序列、蛋白序列及其构建的表达载体和重组工程菌。

背景技术：

1、尼龙因具有优良的机械性能、耐热性、耐腐蚀性等性质而在纤维和工程塑料等多个领域被广泛应用，近年来中国尼龙产量、产能和需求量均呈增长趋势。其中尼龙66的产量和消费量巨大，但由于其核心单体己二胺的前驱体己二腈的合成技术一直被国外企业垄断，资源紧张，成本波动巨大，且主要来源于石油。

2、戊二胺为赖氨酸脱羧的产物，与己二胺互为同系物，由戊二胺和二元酸可以合成多种尼龙5x产品，如尼龙52、5t、54、56、510、516、518等，具有更佳的轻质减重、吸湿排汗、耐温性、耐磨性、染色性及本质阻燃等特性，具有广阔的发展前景。生物尼龙5x的合成不仅能够降低对石油资源的依存度，而且能够打破跨国企业对己二胺产品的输出和技术的垄断，在航天等领域具有广阔的应用前景。

3、生物基尼龙5x的关键是其核心单体戊二胺的高效合成。高效稳定的赖氨酸脱羧酶是生物基戊二胺合成的核心。赖氨酸脱羧酶来源广泛，目前报道存在赖氨酸脱羧酶的微生物主要是大肠杆菌(e.coli)、蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)、耐碱芽胞杆菌(bacillushalodurans)、蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)、尸杆菌(bacterium cadaveris)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(chromobacterium violaceum)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、毛链霉菌(streptomyces polosus)、反刍动物月形单胞菌(selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)等细菌，但目前仅对少数来源的赖氨酸脱羧酶进行深入研究，如来自大肠杆菌和蜂房哈夫尼菌的赖氨酸脱羧酶。

4、cn105316270b、cn105368766a和cn104498519a中公开了利用大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶cada构建不同的基因工程菌株，全细胞催化合成戊二胺。同时，天津科技大学使用温度调控型启动子pr-pl和信号肽pelbs对过表达载体进行改造，中国科学院微生物研究所将t7cadb整合至底盘细胞基因组中，提高了戊二胺产量。cn106148373a、ep3118312b1与us7189543对大肠杆菌的诱导型赖氨酸脱羧酶cada进行序列改造，日本味之素公司通过对cada的定向进化，筛选到热稳定性更高的突变体，三井化学公司也在其专利中公开了活性提高10-20％的突变体。

5、但这些突变酶系均仅局限于对大肠杆菌诱导型赖氨酸脱羧酶cada下改造，来源非常单一，突变菌株在赖氨酸高浓度催化转化过程中活性和催化强度低，细胞循环利用率差，增加了操作时间、生产成本，降低了戊二胺得率而制约了工业化发展。

技术实现思路

1、鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶及其应用，包括赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列、编码其的核苷酸序列、基因表达载体以及重组工程菌。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种用于合成戊二胺的赖氨酸脱羧酶，可催化l-赖氨酸生成戊二胺，所述赖氨酸脱羧酶具有(i)、(ii)或(iii)所示的氨基酸序列中的任意一个：

4、(i)如seq id no.1～4任一项所示的氨基酸序列；

5、(ii)与seq id no.1～4中任一项所示的氨基酸序列具有≥75％同源性的氨基酸序列；

6、(ii)如seq id no.1～4任一项所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个氨基酸获得的氨基酸序列。

7、本发明提供了一种新型高效赖氨酸脱羧酶，所述赖氨酸脱羧酶可以催化l-赖氨酸生成戊二胺，该赖氨酸脱羧酶可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，全细胞催化赖氨酸盐酸盐合成戊二胺。同时，本发明提供的赖氨酸脱羧酶在较高的温度以及ph时仍然稳定，且产量较高。

8、本发明中，将seq id no.1代表的赖氨酸脱羧酶记为ldcedw，所述氨基酸序列与大肠杆菌cada的相似度为86.7％；将seq id no.2代表的赖氨酸脱羧酶命名为ldcaer，其与大肠杆菌cada相似度75.77％；将seq id no.3代表的赖氨酸脱羧酶命名为ldcsal，所述氨基酸序列与大肠杆菌cada的相似度为92.3％；将seq id no.4代表的赖氨酸脱羧酶命名为ldckle，所述氨基酸序列与大肠杆菌cada的相似度为94.4％。而氨基酸序列对于酶的立体结构以及酶学性质有较大影响，有时少量氨基酸的不同也可能会导致两个酶之间有较大的性质差异，其造成的影响是不可预期的。因此，而正是这两者的差异性赋予了ldcedw与大肠杆菌cada不同的酶学性质，也正是这些差异使ldcedw能够实现对高浓度赖氨酸盐酸盐的高效转化。

9、同时，除以上四条序列外，与seq id no.1～4中任一项所示的氨基酸序列具有≥75％(例如同源性大于75％、78％、80％、84％、85％、88％、90％、92％、94％、96％、98％或99％等)同源性的氨基酸序列也可实现赖氨酸盐酸盐的转化。

10、本发明所述的赖氨酸脱羧酶的来源于蜂房哈夫尼菌(hafnia alvei)、耐碱芽胞杆菌(bacillus halodurans)、蜡样芽胞杆菌(bacillus cereus)、尸杆菌(bacteriumcadaveris)、伯克霍尔德氏菌(burkholderia vietnamensia)、青紫色素杆菌(chromobacterium violaceum)、迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、毛链霉菌(streptomyces polosus)、反刍动物月形单胞菌(selenomonas ruminantium)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、邦戈沙门氏菌(salmonella bongori)、沙雷氏菌属(serratia)、博代氏杆菌属(bordetella)、霍乱弧菌(vibrio cholerae)、气单胞菌属(aeromonas)、克雷伯氏菌属(klebsiella)等细菌的赖氨酸脱羧酶基因及其突变体。

11、优选地，所述赖氨酸脱羧酶来源于迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、气单胞菌属(aeromonas)或邦戈沙门氏菌(salmonellabongori)。

12、第二方面，一种编码第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸，所述核苷酸具有(i)、(ii)或(iii)所示的核苷酸序列中的任意一个：

13、(i)编码权利要求1或2所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列；

14、(ii)编码seq id no.1～4任一项所示的赖氨酸脱羧酶的核苷酸序列；

15、(iii)如seq id no.5～8任一项所示的核苷酸序列。

16、所述的ldcedw其核酸序列为seq id no.5所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，gc含量43％，与大肠杆菌cada核酸序列相似度74.5％。所述的ldcaer其核酸序列为seq id no.6所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，gc含量45％，与大肠杆菌cada核酸序列相似度69.2％。所述的ldcsal其核酸序列为seq id no.7所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，gc含量43％，与大肠杆菌cada核酸序列相似度78.1％。所述的ldckle其核酸序列为seq id no.8所示的序列。所述的核酸序列经密码子优化，gc含量43％，与大肠杆菌cada核酸序列相似度78.6％。

17、第三方面，本发明还提供了一种基因表达载体。所述基因表达载体包括：编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸。

18、优选地，所述基因表达载体为pet质粒，优选为petduet质粒。所述表达载体可以是petduet，也可以是大肠杆菌中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体。优选地，所述基因表达载体还包括编码赖氨酸戊二胺反向转运蛋白的核苷酸序列。

19、第四方面，本发明还提供一种如第三方面所述的基因表达载体的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

20、将编码如第一方面所述的氨基酸序列的核苷酸序列或如第二方面所述的核苷酸插入质粒的限制性酶切位点之间，得到所述基因表达载体。

21、所述构建方法还包括插入赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因的操作。

22、优选地，所述赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因前还包括信号肽。

23、优选地，所述信号肽包括大肠杆菌周质空间分泌信号肽。

24、所述的表达载体中以pelb信号肽为例，但不仅限于该信号肽，可以是大肠杆菌常见的，如dsba、hlya、lamb、male、ompa、ompf、ompt、phoa等。

25、示例性的，所述构建方法具体包括如下步骤：

26、将赖氨酸脱羧酶基因ldc和编码赖氨酸戊二胺反向转运蛋白基因cadb，分别插入petduet质粒的ncoi/saci、bglⅱ/pacⅰ限制性酶切位点之间，构建质粒petduet-ldc-cadb，再在cadb序列前引入pelb，通过ndei/bglⅱ限制性酶切位点连接，最终，构建好的表达载体为petduet-ldc-pelb-cadb。

27、第五方面，一种用于合成戊二胺的重组工程菌，包含如第三方面所述的基因表达载体和/或编码第一方面所述的赖氨酸脱羧酶的核苷酸。所述工程菌可以是e.coli bl21(de3)。

28、第六方面，本发明还提供一种利用如第五方面所述的宿主细胞制备戊二胺的方法，所述方法包括如下步骤：

29、将所述重组工程菌培养、诱导后的得到的菌液离心并重悬，得到菌悬液，所述菌悬液与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛(plp)的缓冲液混合反应、离心后得到所述戊二胺。

30、作为本发明优选的技术方案，所述反应的温度为35～65℃，例如可以是35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃等，时间为0.5-24h，例如可以是0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、5h、6h、8h、10h、12h、15h、16h、18h、20h或24h等，优选为1～4h。

31、优选地，所述反应时的振荡速率为400～800rpm，例如可以是400rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm或800rpm等。

32、优选地，所述离心时的转速为8000～12000rpm，例如可以是8000rpm、8500rpm、9000rpm、10000rpm、10500rpm、11000rpm或12000rpm等，时间为1～3min，例如可以是1min、1.5min、2min、2.5min或3min等。

33、优选地，所述缓冲液中赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1～3m，例如可以是0.1m、0.5m、0.8m、1m、1.2m、1.5m、1.8m、2m、2.5m或3m等。

34、优选地，所述缓冲液中plp的摩尔浓度为0.1～0.5mm，例如可以是0.1mm、0.15mm、0.2mm、0.25mm、0.3mm、0.35mm、0.4mm、0.45mm或0.5mm等。

35、优选地，所述缓冲液包括醋酸钠缓冲液、磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液或碳酸钠缓冲液中的任意一种，优选为磷酸缓冲液。

36、优选地，所述缓冲液的ph为5～11，例如可以是5、6、6.4、7、7.2、7.5、8、9、10或11等，优选为6～10；所述缓冲液与重悬时使用的溶液相同。

37、优选地，所述诱导后的菌液离心后，还包括在冻存操作，所述冻存为：在-80℃下冻存1h以上。

38、优选地，所述制备戊二胺的方法包括如下步骤：

39、(1)将重组工程菌培养、诱导后得到的菌液离心，冻存后重悬得到菌悬液；

40、(2)将所述菌悬液与含有赖氨酸盐酸盐和磷酸吡哆醛的缓冲液混合，所述缓冲液中赖氨酸盐酸盐的摩尔浓度为0.1～3m，磷酸吡哆醛的摩尔浓度为0.1～0.5mm，所述缓冲液为磷酸缓冲液，ph为6～10；

41、(3)在35～65℃下以400～800rpm振荡反应1～4h，再以8000～12000rpm离心1～3min，得到戊二胺。

42、本发明中，在合成戊二胺后，检测赖氨酸和戊二胺的方法为：

43、(1)在反应体系中加入600μl 50mm ph 9的硼酸缓冲液、200μl甲醇、60μl稀释样品、130μl ddh2o和10μl 1m乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(deemm)，室温下放置反应10min，转移至60～80℃水浴1～2h，终止反应；

44、(2)使用反相高效液相色谱紫外(nm)检测器进行检测，流动相a为100％的乙腈；流动相b为25mm ph 4.8醋酸钠缓冲溶液，流速0.5ml/min；检测柱为c18；柱检测温度：35℃；进样量：2～10μl；波长：284nm。

45、采用梯度洗脱：0min a:b为20:80；2min a:b为25:75；27min a:b为62.5:37.5；27.01min a:b为20:80；37min a:b为20:80；37.01min结束，所述的梯度洗脱并不仅限于上述梯度洗脱比例。

46、第六方面，本发明还提供一种利用如第一方面所述的赖氨酸脱羧酶、如第三方面基因表达载体或如第五方面所述的重组的宿主细胞在生物基戊二胺合成中的应用。

47、本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

48、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

49、(1)本发明提供了一种能够高效合成戊二胺的新型赖氨酸脱羧酶，所述新型高效赖氨酸脱羧酶同时该赖氨酸脱羧酶可以通过构建表达载体、基因工程菌后诱导表达得到，全细胞催化赖氨酸盐酸盐合成戊二胺时，在ph为5～9、温度为40～60℃下保持稳定，且催化效率较高，催化强度可达136～204g/l/h；

50、(2)本发明提供的新型赖氨酸脱羧酶可实现高浓度赖氨酸盐酸盐近完全转化，在ph 6.5、温度为50℃时，戊二胺转化率最大，可达100％，其催化强度可达204g/l/h，其活性和催化强度均明显高于现有报道的大肠杆菌cada及其突变体，有利于高效合成高浓度戊二胺，有极高的工业应用前景。