一种山羊垂体细胞永生化细胞系及其构建方法

本发明涉及细胞生物学，尤其是指一种山羊垂体细胞永生化细胞系及其构建方法。

背景技术：

1、近年来，我国羊肉的市场需求量很大，消费量急剧上升，各种羊肉的精细加工产品层出不穷，因而规模化肉羊生产成为市场经济发展的必然要求。然而，绵羊、山羊的繁殖率普遍较低的实际情况限制了养羊业的规模化生产。垂体是哺乳动物机体最重要的分泌腺，分为前叶和后叶，垂体后叶为神经垂体，主要分泌抗利尿激素等；前叶也称腺垂体，主要分泌生长激素、催乳素、促性腺激素、促甲状腺激素和促肾上腺皮质激素等。其分泌的促性腺激素和生长激素在调控山羊的繁殖性能和生长性能方面发挥着举足轻重的作用。因此，建立体外培养腺垂体细胞的方法，可用来探讨各种因素直接对细胞分泌功能的影响，以及开展神经内分泌分子生物学的研究。但是山羊垂体细胞体外培养技术尚未成熟，垂体组织较为珍贵且原代培养代数有限，一般不超过三代，限制了对体外研究垂体神经内分泌的进展。细胞永生化技术可使细胞获得持续增殖的特性，克服原代细胞有限的寿命，从而使细胞无限增殖，为体外研究垂体分泌激素的分子机制提供宝贵材料。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种山羊垂体细胞永生化细胞系及其构建方法，可快速、高效的构建山羊垂体细胞永生化细胞系，该细胞系可连续传代，最终得到的细胞可无限增殖且细胞间无差异；可获得大量的细胞资源，节省实验周期，使细胞培养技术得到进一步应用。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种山羊垂体细胞永生化细胞系，将山羊垂体细胞转染sv40后传代培养，持续传代至30代以上。

4、根据上述所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：

5、s1，分离垂体细胞；

6、s2，免疫荧光法鉴定垂体细胞；

7、s3，sv40、sv40t、htert慢病毒包装液转染垂体细胞；

8、s4，传代培养；

9、s5，线粒体物种鉴定；

10、s6，percoll非连续梯度离心法纯化生长激素细胞群；

11、s7，使用gh1抗体标记不同梯度的细胞并检测生长激素细胞含量。

12、优选地，步骤s1中分离垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

13、s11，s11，获取山羊垂体，洗净放入pbs组织清洗液，分离黏附于垂体上的膜和结缔组织，清洗；

14、s12，在洗净的垂体组织中加入ⅳ型胶原酶，剪碎，继续加入ⅳ型胶原酶后消化，离心吸出上清液；

15、s13，在步骤s12吸出的上清液中加入胰蛋白酶二次消化；

16、s14，二次消化完成后，吸出上清液后加入血清的培养液重悬，过滤，离心后加入pbs清洗细胞沉淀1-2次，用完全培养液重悬细胞后接种于培养瓶中培养得到垂体细胞。

17、优选地，步骤s2中免疫荧光法鉴定垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

18、s21，将垂体细胞接种到24孔板培养，待细胞生长至培养皿底面积60％左右，加多聚甲醛室温固定30min，吸去固定液，加入triton-100，通透15min；

19、s22，封闭液室温封闭30min，结束后弃去封闭液，加入fshb和gh1一抗稀释液放入4℃冰箱孵育过夜；

20、s23，次日pbs清洗，加入羊抗兔igg二抗稀释液，室温避光孵育2h，pbs清洗，加入dapi染液避光孵育3-5min；

21、s24，滴加抗荧光淬灭剂，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。

22、优选地，步骤s3中慢病毒包装液转染垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

23、s31，鉴定为垂体细胞后，将垂体细胞接种至培养板，待细胞汇合至60％左右进行慢病毒转染实验，计算公式：病毒体积＝moi×细胞数目/病毒滴度；

24、s32，猿猴病毒sv40、sv40大t抗原慢病毒sv40t、人类端粒酶逆转录酶(htert)分别感染山羊原代垂体细胞，37℃培养12h后更换为完全培养基，继续培养。

25、优选地，步骤s4中传代培养的具体方法包括以下步骤：

26、s41，将分别转染sv40、sv40t、htert的垂体细胞继续传代培养，用胰酶37℃消化2min，吸去胰酶加入含血清的完全培养基将细胞吹打下来，放入离心管中3000rpm离心5min，弃去上清液，加入完全培养基重悬；

27、s42，接种至培养瓶中，补充培养液混匀，放入37℃培养箱培养；

28、s43，记录不同处理组的垂体细胞状态，将状态最佳的sv40处理组垂体细胞持续传代至30代以上。

29、优选地，步骤s5中线粒体物种鉴定的具体方法包括以下步骤：

30、s51，评估dna质量，根据线粒体基因组物种间的保守区域，设计引物进行pcr扩增；

31、s52，pcr反应体系配制，再加石蜡油进行上机扩增；

32、s53，pcr产物电泳确认目的条带，电泳条件设为电压110v，电泳时间30min；

33、s54，进行sanger测序，判断样本物种来源，验证序列比对结果。

34、优选地，步骤s7中使用gh1抗体标记不同梯度的细胞并检测生长激素细胞含量的具体方法包括以下步骤：

35、s71，使用胰酶消化收集细胞，离心，吸除上清液，并使用pbs重悬细胞沉淀继续离心、清洗；

36、s72，使用多聚甲醛重悬细胞沉淀，固定，离心，吸除上清液，并使用pbs重悬细胞沉淀继续离心，清洗；

37、s73，使用triton-100重悬细胞沉淀，打孔，离心，吸除上清液，并使用pbs重悬细胞沉淀继续离心，清洗；

38、s74，gh1抗体稀释，每管细胞使用gh1抗体稀释液重悬细胞沉淀，孵育，离心，吸除上清液，并使用pbs重悬细胞沉淀离心，清洗；

39、s75，alexa fluor 555标记驴抗兔igg稀释，每管细胞使用重悬细胞沉淀，孵育，离心，吸除上清液，并使用pbs重悬细胞沉淀离心，清洗；

40、s76，用pbs重悬细胞沉淀，通过流式细胞仪检测不同密度梯度细胞中gh1的含量。

41、本发明的有益效果：

42、本发明的原理是通过基因转染等技术将外源性永生化基因，如病毒、原癌基因和抑癌基因突变体等，导入目的细胞内，从而建立永生化细胞株，以达到使体外培养的细胞具有无限增殖能力且细胞间无差异的目的。

43、本发明可快速、高效的构建山羊垂体细胞永生化细胞系，该细胞系可连续传代，最终得到的细胞可无限增殖且细胞间无差异，且有望获得分泌单一激素的细胞类群。

44、本发明可获得大量的细胞资源，节省实验周期，使细胞培养技术得到进一步应用。

技术特征：

1.一种山羊垂体细胞永生化细胞系，其特征在于：将山羊垂体细胞转染sv40后传代培养，持续传代至30代以上。

2.根据权利要求1所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s1中分离垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

4.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s2中免疫荧光法鉴定垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

5.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s3中慢病毒包装液转染垂体细胞的具体方法包括以下步骤：

6.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s4中传代培养的具体方法包括以下步骤：

7.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s5中线粒体物种鉴定的具体方法包括以下步骤：

8.根据权利要求2所述的一种山羊垂体细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：步骤s7中使用gh1抗体标记不同梯度的细胞并检测生长激素细胞含量的具体方法包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是指一种山羊垂体细胞永生化细胞系及其构建方法，将山羊垂体细胞转染SV40后传代培养，持续传代至30代以上；包括以下步骤：S1，分离垂体细胞；S2，免疫荧光法鉴定垂体细胞；S3，SV40慢病毒包装液转染垂体细胞；S4，传代培养。本发明可快速、高效的构建山羊垂体细胞永生化细胞系，该细胞系可连续传代，最终得到的细胞可无限增殖且细胞间无差异；可获得大量的细胞资源，节省实验周期，使细胞培养技术得到进一步应用。

技术研发人员：韩燕国,秦歌,张梨,郭家雪,俄广鑫,黄勇富,赵中权,赵永聚
受保护的技术使用者：西南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24