一种重组人凝血因子VIII-Fc融合蛋白的纯化方法与流程

本发明属于蛋白分离纯化领域，具体涉及一种重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的纯化方法。

背景技术：

1、血友病是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病,病症多为自发性或轻度外伤后出血不止,轻则造成患者终生残疾,重则短时间即可危及患者生命。血友病尚无根治办法,目前的治疗方法主要为替代疗法,通过长期输注血浆、缺失的凝血因子的方式来治疗。人凝血因子viii(coagulation factor viii，fviii)是内源性凝血途径中一种重要的凝血因子，作为凝血因子ixa的辅因子，参与凝血因子x的激活。fviii遗传性缺乏将导致甲型血友病(或血友病a)。静注fviii制品替代治疗甲型血友病，是当前的主要治疗手段。由于静注天然结构的fviii在体内半衰期短，预防性治疗需要一周静注3-4次，开发长效fviii有助于提高治疗便利性和患者依从性。长效重组人凝血因子viii-fc融合蛋白能明显提高fviii的稳定性和体内半衰期，达到降低预防性治疗每周用药频次的目的。

2、凝血因子viii(fviii)是多结构的大分子糖蛋白，成熟的蛋白质分子量约为280kda，包含6个结构域为a1-a2-b-a3-c1-c2，除了b结构域外其他结构域在fⅷ蛋白的功能中发挥着关键作用，每个结构域都有针对凝血级联反应中不同组分的特定结合位点。在细胞内加工过程中，全长的人fⅷ(hfⅷ)蛋白在多个位点发生蛋白水解，产生2条多肽链，即分子量约为90-200kda的重链(a1-a2-b)和分子量约为80kda的轻链(a3-c1-c2)。2条链通过金属依赖性的非共价结合作用形成二聚体。在血液中与血管性血友病因子(vonwillebrandfactor，vwf)结合形成fⅷ/vwf复合物。经过活化后fviii参与凝血级联反应。

3、目前，凝血因子viii的纯化工艺普遍存在工艺复杂、成本高、纯度低的问题(stefan winge等,protein expression and purification,2015,115:165-175)。现行的大多数工艺均采用了针对凝血因子viii表位的抗体配基亲和层析，例如ge公司开发出新型纯化填料viii select，填料成本较高，亲和配基的安全性也许进一步考察。蛋白a亲和层析广泛应用于单抗药物的生产，但其洗脱条件往往是强酸性缓冲液，凝血因子viii在此条件下往往会损失大部分的生物学活性。因此，本领域亟待开发一种安全可靠、高效便捷、成本低廉且适于工业应用的纯化重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的新方法。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的纯化方法，包括如下步骤：

2、取含重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的发酵液依次进行亲和层析、疏水层析和阴离子交换层析，收集阴离子交换层析液，即得。

3、进一步地，所述发酵液是经澄清过滤和/或s/d病毒灭活后的发酵液。

4、进一步地，所述亲和层析的步骤包括：

5、取发酵液上样于以蛋白a亲和介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，加tris至ph 6.9-7.1，得亲和层析液；

6、所述淋洗液淋洗三次，第一次淋洗的淋洗液是由10mm l-his-hcl,20mm cacl2,50mm nacl,0.02％ ps80组成的ph 6.6-7.8的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mm l-his-hcl,20mm cacl2,100-400mm nacl,0.02％ps80组成的ph4.9-6.1的水溶液，第三次淋洗的淋洗液是由10mm l-his-hcl,20mm cacl2,50mm nacl,0.02％ ps80组成的ph 6.6～7.8的水溶液；每次淋洗5个柱体积。

7、更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由10mm l-his-hcl,20mm cacl2,50mm nacl,0.02％ps80组成的ph 6.6-7.8的水溶液；

8、和/或，所述层析柱的载量不超过60000iu/ml填料，且发酵液保留时间不低于5min；

9、和/或：所述蛋白a亲和介质选自at proteinadiamond plus、nmab pro、praestojetted a50、mabselect sure、mabselect sure lx中的一种。

10、更进一步地，所述洗脱缓冲液是由10-30mm l-his-hcl，10-30mm cacl2,200-800mm l-arg，100-300mm nacl,以及0.01％-0.05％ ps80或ps20组成的ph 4.0-4.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025au/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.100au/mm结束收集。

11、进一步地，所述疏水层析的步骤包括：

12、取亲和层析时收集的亲和层析液，上样于以丁基疏水层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体，得疏水层析液；

13、所述淋洗液是由20mm his,20mm cacl2,1.4m nacl，0.02％ps80组成的ph 6.4-7.6的水溶液；淋洗5个柱体积。

14、更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mm his,20mm cacl2,1.4m nacl,0.02％ps80组成的ph 6.4-7.6的水溶液；

15、和/或，所述层析柱的载量不超过8mg/ml填料，且亲和层析液保留时间不低于6min；

16、和/或：所述丁基疏水层析介质包括butyl bestarose hp、unihr butyl 30l中的一种。

17、更进一步地，所述洗脱缓冲液是由10-30mm his,10-30mm cacl2,100-300mmnacl,100-500mm l-arg,以及0.01％-0.05％ ps80或ps20组成的ph 6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.010au/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.020au/mm结束收集。

18、进一步地，所述阴离子交换层析的步骤包括：

19、取疏水层析时收集的疏水层析液，上样于以季铵盐类强阴离子交换层析介质为填料的层析柱，依次用淋洗液和洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱缓冲液洗脱的液体；

20、所述淋洗液淋洗二次，第一次淋洗的淋洗液是由20mm his,20mm cacl2,50mmnacl组成的ph 6.4-7.6的水溶液，第二次淋洗的淋洗液是由20mm his,20mm cacl2,310mmnacl组成的ph 6.4 -7.6的水溶液；第一次淋洗3个柱体积，第二次淋洗5个柱体积。

21、更进一步地，所述层析柱是经5个柱体积平衡缓冲液平衡后的层析柱；所述平衡缓冲液是由20mm his,20mm cacl2,50mm nacl组成的ph 6.4-7.6的水溶液；

22、和/或：所述层析柱的载量不超过12mg/ml填料，且疏水层析液保留时间不低于6min；

23、和/或：所述季铵盐类强阴离子交换层析介质选自poros xq、q bestarose hp、nanogel 50q中的一种。

24、和/或，所述洗脱缓冲液是由10-30mm his,10-30mm cacl2,350-800mm nacl组成的ph 6.4-7.6的水溶液；所述收集是紫外吸光值≥0.025au/mm时开始收集，过封顶后，紫外吸光值≥0.025au/mm结束收集。

25、本发明的有益效果:

26、本发明利用层析工艺的优化，通过对亲和层析、疏水层析、阴离子交换层析淋洗条件、洗脱条件等参数的控制，达到了高效纯化重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的目的。其中，解决了传统的proteina亲和层析强酸性洗脱条件造成重组人凝血因子viii-fc融合蛋白生物学活性不可逆地丧失的问题。利用本发明三步层析法纯化重组人凝血因子viii-fc融合蛋白具有收率高，质量佳的特点。三步层析法纯化重组人凝血因子viii-fc融合蛋白500l生物反应器发酵规模，np8f04批原液收率687iu/g上清重量，hcd＜0.2pg/1000iu,hcp＜128ng/mg，sec纯度达99.7％。

27、本发明方法是一种收率高，质量佳，工艺可靠的重组人凝血因子viii-fc融合蛋白的纯化方法，具有非常好的产业化推广应用价值。

28、显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

29、以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。